AR基因外顯子1的CAG重復(fù)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)生的關(guān)系

孟 潔 付 麗

AR基因位于X染色體的長(zhǎng)臂上(Xq11-12)，包括8個(gè)外顯子并編碼919個(gè)氨基酸及殘基的蛋白質(zhì)，其在諸多臨床疾病中值得研究。在AR基因外顯子1中包含高度的[CAG]n重復(fù)多態(tài)性，對(duì)于乳腺癌短重復(fù)長(zhǎng)度發(fā)病危險(xiǎn)下降。本文設(shè)立乳腺癌病例組和健康對(duì)照組，PCR擴(kuò)增AR外顯子1的CAG重復(fù)序列，比較兩組的長(zhǎng)度差異，初步探討AR基因外顯子1 CAG重復(fù)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科2008年6月～9月收治的50例乳腺癌患者及50例健康對(duì)照者，無(wú)血緣關(guān)系，50例術(shù)后病理組織學(xué)診斷為乳腺癌，另50例術(shù)后診斷為良性病變。病例組中7例(7/50，14.0%)至少有一個(gè)一級(jí)親屬患乳腺癌，對(duì)照組中2例(2/50，4.0%)有乳腺癌家族史。病理類(lèi)型主要為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。

1.2 方法

外周血標(biāo)本分別編號(hào)置于無(wú)菌凍存管中，立即放入-180℃液氮中，而后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

組織基因組DNA的提取：基因組DNA是從外周血淋巴細(xì)胞通過(guò)E.Z.N.A.Tissue DNA Kit試劑盒提取的。

DNA體外擴(kuò)增——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：一對(duì)正義和反義寡核苷酸引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。外顯子1上游引物序列：5' GTG GAA GAT TCA GCC AAG CTC 3'；下游引物序列：5' TTG CTG TTC CTC ATC CAG GAC 3'。反應(yīng)體系25 μl，條件為預(yù)變性95℃ 4 min、94℃ 45 s、66.6℃ 30 s、72℃ 30 s，完成35個(gè)循環(huán),最終延伸72℃ 7 min,4℃保存。

DNA序列測(cè)定：取PCR產(chǎn)物10 μl送至上海申能博彩生物科技有限公司，完成DNA純化及DNA直接序列測(cè)定，計(jì)算重復(fù)頻率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

比較CAG重復(fù)長(zhǎng)度及平均重復(fù)長(zhǎng)度,在所有可能的分界點(diǎn)，將長(zhǎng)度以二分法分類(lèi)，采用χ2和Fisher精確檢驗(yàn)比較。Wilcoxon rank test 檢驗(yàn)兩組[CAG]n分布；將重復(fù)頻率分為≤20、≤21、≤22、≤23、≤24、≤25、≤26幾組，采用多因素log回歸分析CAG重復(fù)頻率對(duì)乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估，α=0.05，采用SPSS11.0完成。

2 結(jié)果

病例組發(fā)病年齡43～56歲，中位年齡為50歲，對(duì)照組年齡46～62歲，中位年齡為53歲。兩組年齡分布無(wú)差異(P=0.06)。 病例組中7例 (7/50，14.0%)有乳腺癌家族史，對(duì)照組中2例(2/50，4.0%) 有乳腺癌家族史，兩組比較無(wú)差異(P=0.16)。

病例組CAG重復(fù)頻率為15～26(中位數(shù)23)，對(duì)照組CAG重復(fù)頻率為16～26(中位數(shù)22)，例如：AGGGGAGGGAGTTAGGGCTGGGAGGGTCTACCCTCGGCCGCCGTCCAAGACCTACCGAGGAGCTTTCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGCGCGAAGTGATCCAGAACCCGGGCCCCAGGCACCCAGAGGCCGCGAGCGCAGCACCTCCCGGCGCCAGTTTGCTGCTGCTGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGAATCACCACCAGCAGCATCACCCCCAGCAGGAGGAGGATGGTTCTCCCGAGGATGGTCCTCCACGCCCCCCTCGCTAACTGCCCCTGGATGAGGTGCAGCAGAATGAGGAACAGCAAAAGCA。Wilcoxon rank 檢驗(yàn)兩組[CAG]n分布有差異(統(tǒng)計(jì)量為2.426，P=0.015)(圖1)。

CAG重復(fù)頻率與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果：當(dāng)[CAG]n分界點(diǎn)為24時(shí)，P<0.05，即重復(fù)頻率≥24，乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為重復(fù)頻率≤20的5.6倍 (表1)。

圖1 兩組CAG重復(fù)頻率

表1 CAG重復(fù)頻率對(duì)乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估

3 討論

內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的性激素對(duì)乳腺癌發(fā)生有促進(jìn)作用，大部分乳腺組織表達(dá)ER、PR、AR，性激素通過(guò)這些受體發(fā)揮作用[1]。在乳腺組織中AR與乳腺細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)相關(guān)。雄激素可通過(guò)轉(zhuǎn)化為雌二醇、與激素結(jié)合蛋白競(jìng)爭(zhēng)，或直接與AR結(jié)合，來(lái)影響乳腺細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)于乳腺癌，短重復(fù)長(zhǎng)度發(fā)病危險(xiǎn)下降， AR基因CAG重復(fù)長(zhǎng)度增加，AR基因轉(zhuǎn)錄能力下降，AR活性降低，使雄激素在乳腺組織中通過(guò)AR發(fā)揮抗有絲分裂能力下降，促進(jìn)乳腺癌發(fā)生，乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高。

有研究表明[2]，多因素COX回歸分析AR(+)預(yù)后良好，可作為輔助預(yù)后因子，進(jìn)一步分析在預(yù)后相對(duì)較差的淋巴結(jié)受累及HER2表達(dá)陽(yáng)性患者中，AR表達(dá)對(duì)預(yù)后的進(jìn)一步分析有價(jià)值，即AR(+)預(yù)后好于AR(-)。

AR基因外顯子1 CAG重復(fù)長(zhǎng)度因人群而異，一般重復(fù)長(zhǎng)度10～40。同時(shí)分析界點(diǎn)的不同，亦有人種差異。Giguere等[3]雖然發(fā)現(xiàn)CAG重復(fù)長(zhǎng)度與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān),但基因型分界點(diǎn)不同,當(dāng)OR=0.5時(shí),CAG分界點(diǎn)為≤20；Elhaji等[4]研究認(rèn)為CAG重復(fù)≥26則乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高了2.4倍，還有部分學(xué)者亦發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)的[CAG]n與乳腺癌發(fā)生相關(guān)[5，6]。

同時(shí)也有文章持相反結(jié)論，Spurdle 等[7，8]分析了368例乳腺癌和284例對(duì)照組，未發(fā)現(xiàn)[CAG]n≤22與乳腺癌發(fā)生有關(guān)。Christopher 等雖無(wú)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，但在具有一級(jí)乳腺癌家族史的女性中長(zhǎng)[CAG]n會(huì)增大乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

因此，總結(jié)既往文獻(xiàn)，歐美文獻(xiàn)表明長(zhǎng)[CAG]n與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增大相關(guān)，亞洲大多研究顯示兩者無(wú)關(guān)[9],結(jié)論相反的原因之一是患者種族不同。

本文結(jié)果表明，50例病例組和50例對(duì)照組CAG重復(fù)頻率分布有差異，并且當(dāng)分界點(diǎn)為24時(shí)，即[CAG]n≥24的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為≤20的5.6倍。由于本文例數(shù)較少，未進(jìn)一步分析年齡及家族史因素。

從某方面講，乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)可能與雄激素的活性相關(guān)，由于AR基因中包含高度的[CAG]n重復(fù)序列，其編碼谷氨酰胺合成酶束，此束道長(zhǎng)度越短，AR轉(zhuǎn)錄能力越強(qiáng)，雄激素與AR親和力越強(qiáng)，雄激素效應(yīng)越強(qiáng)，因此，短[CAG]n者乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著下降[10]。

總之，無(wú)論從先期研究中AR對(duì)乳腺癌的預(yù)后價(jià)值，抑或CAG重復(fù)頻率與乳腺癌的關(guān)系，我們認(rèn)為，AR外顯子1的三核苷酸重復(fù)長(zhǎng)度與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，下一步工作是闡明雄激素與AR通過(guò)何種機(jī)制影響乳腺上皮細(xì)胞增殖及導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生。

[1] 張 晟，劉 鵬，只向成.ER、PR及C-erbB-2表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征及其與預(yù)后的關(guān)系〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2009，24(5)：447.

[2] 孟 潔，付 麗.年輕乳腺癌患者的病理學(xué)和生物學(xué)特征及其與預(yù)后的關(guān)系〔J〕.中華腫瘤雜志，2007，29(4)：278.

[3] Giguere Y,Dewailly E,Brisson J,et al.Short polyglutamine tracts in the androgen receptor are protective against breast cancer in the general population〔J〕.Cancer Res,2001,61:5869.

[4] Elhaji Y,Gottlieb B,Lumbroso R,et al.The polymorphic CAG repeat of the androgen receptor gene:a potential role in breast cancer in women over 40〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2001,70:109.

[5] Wei W,Esther M,Sue A，et al.Androgen receptor and prostate-specific antigen gene polymorphisms and breast cancer in African-American women〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005,14(12):2990.

[6] Nicola M,Kathleen E,Janet R,et al.Androgen receptor(C-

AG)n and (GGC)n polymorphisms and breast cancer risk in a population-based case-control study of young women〔J〕.Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention,2003,12:127.

[7] Spurdle A,Dite G,Chen X,et al.Androgen receptor exon 1 CAG repeat length and breast cancer in women before age forty years〔J〕.J Natl Cancer Inst,1999，91:961.

[8] Christopher A,Myles B,Susan E,et al.The androgen receptor CAG repeat polymorphism and risk of breast cancer in the nurses’ health study〔J〕.Cancer Research，2002,62:1045.

[9] Singh R,Lalji S,Kumarasamy T.Phenotypic heterogeneity of mutations in androgen receptor gene〔J〕.Asian J Androl,2007,9 (2):147.

[10] Francesmary M.Ovarian cancer and polymorphisms in the androgen and progesterone receptorgenes:a huGE review〔J〕.Am J Epidemiol,2004,159(4):319.