蛋白組學技術在腫瘤標志物研究中的現狀及展望

胡婷婷 胡維博綜述 史 健審校

目前腫瘤標志物的檢驗技術有三大類：生物化學、免疫學、分子生物學方法。免疫法中放射免疫測定(RIA)，酶聯免疫測定(ELISA)和免疫熒光測定(IFA)在臨床中最常用，近年來雙向電泳(2-DE)、PCR、生物芯片、FISH、表面增強激光解吸電離飛行時間質譜( SELDI-TOF-MS)等各項新的技術迅速發展。理想的腫瘤標志物應具有敏感性及特異性高、器官特異性好、半衰期短等特點，而檢測方法應精密程度、準確性高，易操作，價格低廉[1]。本文將對蛋白組學技術在腫瘤中的應用進行綜述。

1 蛋白組學在腫瘤標志物研究中的意義

應用雙向電泳聯用質譜技術，蛋白組學規模化地尋找多個與腫瘤相關的蛋白質或蛋白質群，并對其進行定性、定量分析，從整體網絡水平了解細胞內信號轉導途徑，提示腫瘤發病機制，發現腫瘤早期篩選檢測和治療的標志物，必將更科學地指導分子診斷、基因治療，為攻克惡性腫瘤提供更有利的技術支撐。

2 目前蛋白組學在惡性腫瘤研究中的應用情況

惡性腫瘤的發生、發展過程中，蛋白譜必然會發生一系列變化。腫瘤蛋白質組學主要是通過尋找腫瘤組織或細胞系、血漿與正常樣品之間的差異蛋白，初步篩選出與腫瘤相關蛋白質，并后續應用免疫組化、Western、基因轉染后確定其表達的差異，通過PCR等技術進行驗證，并在早期診斷、細胞凋亡及耐藥性、 轉移機制、監測療效和預后方面進行廣泛而深入地研究，我們將著重介紹其在腫瘤細胞株中的研究情況。

2.1 在惡性腫瘤早期診斷中的應用

病理診斷是惡性腫瘤診斷的重要依據，但惡性腫瘤依靠影像學及病理診斷時多數已到晚期，目前臨床上多通過腫瘤標志物的檢測來對早期惡性腫瘤進行普查、鑒別良惡性疾病。在早期發現惡性腫瘤方面，腫瘤標志物的檢測擁有獨特的優勢。很多有效的診斷標志物存在于蛋白質譜(包括差異表達譜、修飾譜)中，并能有效地指導治療，因此蛋白組學對于發現惡性腫瘤各個病種特異性標志蛋白，為疾病的早期診斷、個體化治療提供更好的技術平臺[2,3]。

在乳腺癌的研究中，Belluco等[4]已建立起早期患者診斷的蛋白圖譜。Li等[5]通過對比乳腺癌及乳腺良性疾病患者的蛋白質表達，發現BC1、BC2、BC3在區分良惡性乳腺疾病方面具有特異性，并在后續的試驗中證實，BC2、BC3分別為補體C3a及其片段。Alexander等[6]發現巨囊性病液狀蛋白(GCDFP-15)、載脂蛋白D(apoD)和α1-酸性糖蛋白(AAG)在乳腺癌患者中呈正調節，且與良性乳腺疾病相比，乳腺癌患者的GCDFP-15水平顯著下降，AAG 水平升高，而apoD 則沒有顯著差異。

王平等鑒定出了包括ATP合成酶、組織蛋白酶、熱休克蛋白60、氯離子通道蛋白、乙二醛酶、異質核核糖蛋白A、異質核核糖蛋白AZ/BI和KH型剪切調控蛋白等22種與胃癌相關的蛋白質。

宋大平等[7]通過亞細胞結構蛋白提取法，對比HPV陽性的宮頸永生化細胞及宮頸癌細胞，發現8個可能參與癌前病變向癌轉化的差異蛋白，其中3個在宮頸癌細胞株中上調，1 個明顯下調，2個缺失,另外 2個在永生化細胞株缺失，遺憾的是未行差異蛋白的驗證。

賈小芳等[8]在應用蛋白組學技術，研究人鼻咽癌細胞系(HNE1和CNE1)與永生化的鼻咽上皮細胞系時鑒定出33個蛋白質，其中15個在腫瘤細胞中上調，18個下調，并通過免疫印跡證實與細胞的增殖、凋亡、腫瘤的轉移等相關。

2.2 在惡性腫瘤的轉移機制中的應用

眾所周知，腫瘤的侵襲、遠處轉移是惡性腫瘤的生物學特性，是腫瘤患者死亡的主要原因。研究惡性腫瘤的轉移機制，并適當干預，甚至達到逆轉轉移，對改善預后具有重要意義。

臨床前期研究證明，Hsp27是涉及細胞骨架的穩定,耐藥性的產生,細胞凋亡等的1種重要蛋白，其在乳腺癌患者中過表達能增加乳腺癌細胞的侵襲及轉移能力。陳棟等[9]以Hsp27高表達的乳腺癌細胞株MCF-7為親本，通過質粒轉染技術，分別導入靶向shRNA敲減載體和對照空載體，分別構建成穩定的細胞系即對照細胞株( Hsp27-KD-NC 細胞株) 和Hsp27敲減細胞株( Hsp27-KD 細胞株)，進行免疫印記鑒定Hsp27的表達量，然后應用雙向凝膠電泳及MALDI-TOF-TOF質譜分析技術鑒定出7個差異蛋白點，其中共有4個蛋白點被定性，包含了3種蛋白質，其中2個被鑒定的是Hsp27,另外2個點分別為OVCA2(其在Hsp27-KD-3B2細胞株表達增高)和PYRG2(其在Hsp27-KD-3B2細胞株表達降低),這2種蛋白首次被證實其表達受 Hsp27的影響。

朱文等[10]比較了人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981和人低轉移大細胞肺癌細胞NL9980，有15個蛋白質點僅在L9981中出現,有27個蛋白質點僅在NL9980中出現。

國內外研究證實，nm23-H1基因作為1種腫瘤轉移抑制基因，其缺失常伴有侵襲相關分子如E-cadherin，integrin，selectin，VEGF等異常表達，導致肺癌的高轉移性和預后差。鄧幼林等[11]發現，轉染抑癌基因nm23-H1后，原代人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981中6個蛋白缺失，17個新的蛋白表達，5個上調，8個下調。這種變化與之前周清華等[12]發現的轉基因人高轉移大細胞肺癌細胞株(L9981 nm23-H1)中β-catenin、E-cadherin、TIMP-1、CD44S 基因mRNA和蛋白轉錄表達顯著上調，而MMP-2、MMP-9、CD44V6、VEGF、E-seletion基因mRNA和蛋白轉錄表達顯著下調可能有相關性。

馮燕國等[13]驗證了在小細胞肺癌中存在膜聯蛋白A1 ( Annexins A1)，可能引起細胞集落形成能力增強以及細胞間黏附能力減弱,從而促進腫瘤細胞轉移的發生。而劉迎福等[14]則進一步在肺腺癌中驗證annexin A1，annexin A2，annexin A3，B23和S100A9等蛋白與轉移相關。

李群等[15]通過比較人高低轉移性前列腺癌細胞株，鑒定出11種蛋白質，其中9種僅在低轉移性細胞株中表達，另外2種僅在高轉移性細胞株中表達，涉及到的蛋白種類可分為結合蛋白、凋亡相關蛋白、細胞骨架蛋白及具有磷脂酶C活性的蛋白、具有運載體活性的蛋白，尤其推測其中名為78000 glucose-regulated protein precursor的蛋白與前列腺癌的轉移密切相關。

孫成榮等研究高低淋巴道轉移性肝癌細胞株，鑒定出168種可能與淋巴道轉移相關的差異蛋白，涉及代謝及信號傳導通路等因素。

在鼻咽癌轉移標志物研究中，通過研究高低轉移性鼻咽癌細胞系的差異蛋白，陳麗霞等[16]發現了6種可能與轉移相關的蛋白：丙酮酸激酶、β肌動蛋白、20s蛋白酶體、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶、蛋白酶β-6亞基和血小板活化因子乙酰水解酶，并應用免疫組化技術驗證，丙酮酸激酶在高分化鼻咽癌細胞株中明顯高于在低分化細胞株中。

2.3 在腫瘤細胞耐藥性機制研究方面

研究資料表明，腫瘤細胞多藥耐藥性的產生，導致化療失敗，是造成腫瘤患者侵襲及遠處轉移，死亡率升高的重要因素。既往對腫瘤細胞多藥耐藥性產生機制的研究大多是從某個或某幾個基因出發的，且大多集中于DNA、RNA的水平；然而有研究者指出，基因的mRNA表達水平與翻譯后蛋白質表達水平之間的相關性為0.4～0.5，而蛋白質組學的技術解決了經蛋白質翻譯后加工和修飾以及它們的亞細胞分布情況等問題，從而使得在蛋白質整體水平上來揭示腫瘤多藥耐藥的詳細分子機制成為可能。

紫杉醇(Taxol，TAX)作為治療婦科惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌的重要化療藥物，張正華等[17]以MCF-7及其紫杉醇耐藥株MCF-7/Taxol細胞株為靶細胞，應用親和免疫磁珠層析法獲得紫杉醇的結合蛋白，通過SDS-PAGE電泳、LC-MS/MS分析、Western blot驗證差異條帶中有HSP90、Dermcidin Precursor、Actinin，可能為抗腫瘤藥物的研究尋找新的蛋白靶點、發現新的腫瘤耐藥機制。張永亮等篩選出初步定性的蛋白：1，6-二磷酸酶、膜聯蛋白A2、β-促性腺激素和Ras相關核蛋白，分別涉及腫瘤轉移、能量代謝、細胞增殖等相關環節。

Smith等[18]通過對比 MCF-7乳腺癌細胞組和順鉑耐藥組，應用MALDI-TOF-MS技術進行分析，發現在順鉑耐藥組，細胞角蛋白17、熱休克蛋白、核糖體蛋白等9種蛋白低表達，基質金屬蛋白酶9、β1蛋白酶體等6 種蛋白高表達，這些生物學標記物有待進一步臨床驗證。

在肺癌細胞多藥耐藥性的研究中，有學者驗證出肺腺癌對順鉑耐藥性的產生與Heat shock protein beta27，ArmexinA2，Cofilin-1，Histone-H4，Triosephosphate isomerase，Peroxinredoxin-4，Vimentin，Proteasome subunit alphatype6，fatty acid-binding proteins，Elongation factor-1等蛋白密切相關。孫強玲等[19]通過熒光差異凝膠電泳，研究紫杉醇耐藥及敏感細胞株，鑒定出了涉及代謝酶類、細胞外基質降解酶類、黏附分子、細胞因子和信號轉導等19種蛋白。

有學者在卵巢癌細胞株順鉑耐藥性的研究方面，提出了14-3-3σ,14-3-3ζ和hNASP，并應用Western blot獲得了前者免疫印記圖譜，后續仍需進一步驗證。周莉等[20]研究掌葉半夏總蛋白對卵巢癌細胞的影響，構建了清晰、重復性好的蛋白圖譜，并分析出550個差異蛋白點，為研究中藥抗癌提供了新的思路。

甲氨蝶呤為治療絨癌的首選化療藥物，馬海鷗等[21]建立了人絨癌耐藥細胞株JAR /MTX蛋白質組雙向凝膠電泳圖譜，并分析鑒定出1種細胞骨架相關蛋白：埃茲蛋白(ezrin)，并推測此種蛋白過量表達可能抑制腫瘤細胞凋亡，促進浸潤、轉移。

田浪等[22]對阿霉素耐藥的肝癌細胞株HepG2研究，發現了45個差異蛋白點，其中在HepG2/ADM中有7個特異性表達，25個上調，9個下調，在HepG2細胞株中有4個蛋白點特異性表達。

2.4 在惡性腫瘤的預后方面

在食管癌的前期研究中，Ferdous等[23]發現了β-原肌球蛋白(TMβ)、熱休克蛋白70(HSP70)、鈣磷脂結合蛋白Ⅰ(annexin Ⅰ)、鈣網織蛋白(calreticulin)和肌球蛋白一些亞型的表達失調可以作為多種消化系統腫瘤的分子標志物。其后Norihisa等[24]發現谷氨酰胺轉移酶-3(TGM-3)與患者生存率正相關，并應用免疫組化進行了驗證。

2.5 在細胞周期及其它方面

從細胞周期的角度研究增殖活性與腫瘤的發生及發展是近年研究的熱點。正常細胞癌變是細胞過度增殖、凋亡減少與分化受阻的結果。前期研究已構建了清晰、重復性好的肝癌細胞株HepG2在G1期的蛋白圖譜。前期研究發現2個卵巢癌中的候選的腫瘤抑制因子OVCA1和OVCA2，可能作為1種具有重要生理作用的旁分泌型的激素，參與細胞凋亡過程。而PYRG2編碼CTP合成酶2，是CTP合成中的限速酶，在許多生長旺盛的癌細胞中，這些酶的活性是升高的，因此近年來CTP合成酶是許多癌癥治療的1個靶點，遺憾的是尚未有HSP27影響CTP-2合成機制的研究。

此外，前列腺癌治療的失敗主要是因為由激素依賴期發展為非依賴期，進而發展為激素難治期，導致內分泌治療無效。王軒久等[25]對這一轉化的機制進行了蛋白組學的研究，鑒定出41個3倍差異點及對應著3種蛋白質的10個完全差異點，完全差異點中有1個已知蛋白質是KIAA1283蛋白質,具有載脂蛋白功能；另外首次發現了2個未命名蛋白，有待于進一步研究驗證。

3 蛋白組學技術與其它檢測方法的共性與區別

腫瘤標志物在檢測水平上分為血清、細胞、分子與遺傳標志物。現有的檢測方法都存在靈敏度差的問題，多數都是在發生某些癥狀和體征后才發現，難以早期發現某些腫瘤標志物異常，或是難以進行高通量的檢測、或因檢測方法價格昂貴難以廣泛用于臨床，導致患者明確診斷時多屬晚期，預后差。

蛋白組學區別于其它檢測方法，在于其摒棄其它檢測方法每次僅可檢驗單一腫瘤標志物的局限性；且其它方法針對部分與腫瘤相關的抗原進行檢測，往往敏感度和特異性差，且具有假陽性、假陰性。多變量分析的蛋白質組學應用被認為在臨床應用中更有意義。

蛋白組學相對比其它免疫學檢測方法而言，是1種新的高通量的技術手段，具有上樣量少，可檢出微量蛋白，敏感度、特異性更高的特點，能動態、整體、定量的觀察腫瘤發生的過程，通過與正常細胞、組織等相對比，得出疾病相關特異性蛋白質，這對惡性腫瘤的診斷、治療的指導更有針對性、靶向性、個體化。

總之，目前蛋白質組學在篩選腫瘤標志物方面占有重要地位，特別是初步篩選腫瘤細胞轉移相關蛋白及耐藥相關蛋白，為逆轉腫瘤細胞浸潤轉移，準確選擇有效藥物提供新的思路；而亞細胞器的分離及蛋白純化技術的大力支撐，使取材更加具有針對性；再加上基因轉染技術、免疫印記、免疫組化、聚合酶鏈反應等其它科研方法，必將是人類解釋腫瘤規律，從而攻克腫瘤的新希望。但蛋白組學技術具有價格昂貴、樣品的分離和提純技術要求高、對操作人員技術水平的要求、受限于圖像分析方法等特點，在廣泛臨床應用中還存在很多問題，仍有待于進一步解決。

[1] 陳紅波.腫瘤標志物檢測在臨床上的應用價值〔J〕.中國實用醫藥，2009，4(18):128.

[2] Rifai N，GilletteMA，Carr SA，et al.Protein biomarker discovery and validation:the long and uncertain path to clinical utility〔J〕.Nat Biotechnol，2006，24 (8):971.

[3] Kumar S，Mohan A，Guleria R.Biomarkers in cancer screening，research and detection:present and future 〔J〕.Biomarkers,2006，11(5):385.

[4] Belluco C,Petricoin EF,Mammano E,et al.Serum proteomic analysis identifies a highly sensitive and specific discriminatory pattern in stage Ⅰ breast cancer〔J〕.Ann Surg Oncol,2007，14(9):2470.

[5] Li J，Zhang Z，Rosenzweig，et al.Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer〔J〕.Clin Chem,2002,48(8):1296.

[6] Alexander H,Stegner AL，Wagner-Mann C，et al.Proteomic analysis to identify breast cancer biomarkers in nipple aspirate fluid〔J〕.Clin Cancer Res,2004,10(22):7500.

[7] Song Da- ping，Zhao Ping，Wu Jingxian，et al.Establishment and analysis of 2-DE patters of cytoplasmic proteomics of immortalized cervical cell and cervical cancer cell〔J〕.Journal of Chongqing Medical University，2008,33(2):166.

[8] Jia Xiaofang，Shi Ni，Xiong Jixian，et al.Comparative proteome analysis of nasopharyngeal carcinoma cell lines with an immortalized nasopharyngeal epithelial cell line NP69〔J〕.Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2008,24(1):11.

[9] 陳 棟，蔣宇翔，王 瑋,等.Hsp27 高表達和低表達乳腺癌細胞的比較蛋白質組學研究〔J〕.浙江理工大學學報，2009,26(5):770.

[10] 朱 文，鄧幼林，周清華,等.人高、低轉移大細胞肺癌細胞株雙向凝膠電泳圖像分析〔J〕.中國肺癌雜志，2005,8(1):1.

[11] 鄧幼林，朱 文，周清華,等.nm23-H1基因轉染前后人高轉移大細胞肺癌細胞株雙向凝膠電泳圖譜分析〔J〕.中國生物化學與分子生物學報,2005,21(5):628.

[12] Zheng HaiXia，Zhou QingHua，Sun ZhiLin，et al.Regulation of nm23-H1 transfection on expression of integrins in human high-metastasis large cell lung cancer cell line L9981〔J〕.Chin J Lung Cancer，2004，7 (2):108.

[13] 馮燕國,張賀龍,馮英明,等.小細胞肺癌細胞系SBC-5蛋白質組雙向凝膠電泳圖譜的建立〔J〕.Modern Oncology，2008,16(6)：86.

[14] 劉迎福，肖志強，張鵬飛,等.人原發性肺腺癌轉移相關分子的定量蛋白質組學研究〔J〕.Progress in Biochemistry and Biophysics,2009，36(4):448.

[15] Li Qun，Li Yilei，Chang Ming，et al.Analysis of differential gel electrophoresis of human prostate cancer cell lines with different metastasis potential〔J〕.Journal of Jilin Univercity(Medicine Edition),2008,34(2):343.

[16] Chen Lixia.Screening NPC proteomics technology transfer-related protein〔D〕.南寧：廣西醫科大學碩士研究生學位論文，2009.

[17] 張正華，李曉華.人乳腺癌細胞株MCF-7及其紫杉醇耐藥株中紫杉醇結合的差異蛋白質分析〔J〕.中國藥理學通報，2010，26 (2):217.

[18] Smith L，Welham KJ，Watson MB，et al.The proteomic analysis of cisplatin resistance in breast cancer cells〔J〕.Oncol Res，2007，16(11):497.

[19] Qiangling SUN，Xiaohua YANG，Jing LU，et al.Analysis of differential gel electrophoresis of paclitaxol resistant and sensitive lung adenocarcinoma cells' secretome〔J〕.Chin J Lung Cancer，2009，12(7):735.

[20] Zhou Li，Wang Han-chu，Zheng Feiyun，et al.Alteration of protein profiles in human ovarian cancer cell line SKOV3treated with protein of pinellia pedatisecta schott〔J〕.CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE，2010，28(4):789.

[21] Ma hai-ou，Li Ju，Su Chang,et al.Establishment of two - dimensional gel electrophoresis prof iles of proteome from drug- resistant choriocarcinoma cell line JAR/MTX〔J〕.中國婦幼保健，2009,24(9):1268.

[22] Tian Lang，Zhang Zhiwei，Chen Xiaoping，et al.Differential analysis of two-dimensional gel electrophoresis profiles of proteins in multidrug resistant human hepatocellular carcinoma cell line HepG2/ ADM and its counterpart HepG2〔J〕.腹部外科，2008,21 (3)：178.

[23] Jazii FR，Najafi Z，Malekzadeh R，et al.Identification of squamous cell carcinoma associated proteins by proteomics and loss of beta tropomyosin expression in esophageal cancer〔J〕.World J Gastroenterol,2006,12(44):7104.

[24] Uemura N，Nakanishi Y，Kato H，et al.Transglutaminase 3 as a prognostic biomarker in esophageal cancer revealed by proteomics〔J〕.Int J Cancer，2009,124(9):2106.

[25] Wang Xuanjiu，Zhou Liqun.Research of differential proteomics in p-rostate cancer by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry〔J〕.Shanxi Med Univ，2008,39(4):293.