M2 型巨噬細胞通過分泌白細胞介素-10 調控膽囊癌細胞增殖、遷移和侵襲的研究

趙向陽，江博文，陶 滔，談 燚

（蚌埠醫科大學第一附屬醫院肝膽外科，安徽 蚌埠 233004）

膽囊癌（gallbladder cancer， GBC）是一種常見的膽道惡性腫瘤，約占80%～95%，該病具有侵襲性且易發生轉移，所以致死率高，5 年生存率低于5%［1-3］?，F階段對GBC 發生機制的認識尚不充分，積極挖掘新的分子靶點并針對性開發相應藥物將有助于改善GBC 預后狀況。

腫 瘤 微 環 境（tumor microenvironment， TME）是一個參與腫瘤生長和發展每個階段的復雜生態系統，主要構成有腫瘤細胞、多種免疫細胞和細胞因子以及細胞外基質等。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages， TAMs）是TME 中含量很高的一種免疫細胞，主要分為M1 型和M2 型，其中M2 型即TAMs 一般所指代的巨噬細胞，能夠促進腫瘤生長和轉移以及抑制免疫應答［4-6］。白細胞介素-10（IL-10）是Ⅱ類細胞因子家族的成員，其生物活性形式是一種可溶性的36 kDa 同源二聚體［7］。IL-10 可由巨噬細胞、多種T 細胞和腫瘤細胞等細胞分泌，并在腫瘤中可發揮免疫抑制作用，降低免疫細胞對癌細胞造成的損傷［8］。此外，IL-10 還在部分腫瘤中被證實可以促進癌細胞的增殖和轉移，包括神經膠質瘤［9］、非小細胞肺癌［10］、肝癌［11］、卵巢癌［8］等。IL-10 的濃度在包括GBC 在內的多種腫瘤中顯著升高［12］，但目前在GBC 中關于IL-10 生物效應方面的研究偏少。本實驗意在探討M2 型巨噬細胞對膽囊癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以及IL-10 在該調控中的作用，為將來膽囊癌臨床治療的開展提供新的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要材料

人單核細胞株THP-1 購自ATCC 公司；人GBC 細胞株NOZ 和GBC-SD 由蚌埠醫學院第一附屬醫院徐明課題組惠贈；佛波酯、人重組IL-4 和IL-13 購 自MCE 公 司；RPMI 1640 培 養 基 選 自Gibco 公司；人IL-10 中和抗體購自Biolegend 公司；ELISA檢測試劑盒選自江蘇晶美公司；CCK-8 檢測試劑盒選自上海碧云天公司；Matrigel 膠選自BD 公司；Trizol 購自Takara 公司；cDNA 逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購自近岸蛋白質公司；兔源多克隆抗體E-cadherin 和鼠源單克隆抗體Vimentin 選自武漢三鷹公司；兔源多克隆抗體GAPDH、鼠二抗和兔二抗購自愛博泰克公司。

1.2 細胞培養與處理

THP-1、NOZ 和GBC-SD 細 胞 在37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基進行常規培養。誘導實驗時，將THP-1細胞種入六孔板（細胞密度為1×106個），先用150 nmol/L 的PMA 誘導24 h，更換新鮮培養基后，再用20 ng/L 的IL-4 和IL-13 誘導48 h 即為M2 型巨噬細胞，誘導前后拍照記錄；誘導完成后棄舊培養基，更換新鮮無血清培養基再培養48 h，收集上清作條件培養基（M2-CM）。實驗分組：Control 組（用不含血清的培養基作對照處理）、M2-CM 組（用M2-CM 處理）、M2-CM+anti-IL-10 組（用含10 μg/L 的IL-10中和抗體的M2-CM 處理）、M2-CM+IgG 組（用含10 μg/L 的IL-10 同型對照抗體的M2-CM 處理）。

1.3 RT-qPCR 實驗

收集誘導前后的THP-1 細胞，Trizol 法提取細胞RNA，檢測RNA 濃度，定量并逆轉錄合成cDNA，根據熒光定量PCR 試劑盒使用說明對樣品中的待測基因定量分析。采用2-ΔΔCT計算每個基因的相對表達量。用于實驗的引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.4 ELISA

收集THP-1 和M2 巨噬細胞的上清液，參考ELISA 試劑盒說明書，分別檢測兩組細胞上清中IL-10 的表達量。

1.5 CCK-8 實驗

取處于對數生長期的NOZ 和GBC-SD 細胞懸液加入96 孔板中（每孔100 μL，3 000 個），待細胞貼壁 后，按 各 組 要 求 分 別 孵 育0 h、24 h、48 h 和72 h后，以10∶1 比 例 向 每 孔 加 入CCK-8 溶 液，再 孵 育120 min，上酶標儀檢測各組450 nm 處的吸光度值。

1.6 劃痕實驗

制備NOZ 和GBC-SD 細胞的細胞懸液并鋪板于6 孔板中，待細胞長滿后，用無菌槍頭在孔內均勻劃直線，分組處理48 h。在0 h 和48 h 觀測劃痕寬度并拍照，而后利用Image J 軟件計算細胞遷移率。

1.7 Transwell 實驗

將Matrigel 液與預冷無血清培養基充分混勻，加入每個上室后，于37 ℃培養箱放置1 h。取預先處理的NOZ 和GBC-SD 細胞（分組處理了72 h），用無血清培養基制備細胞懸液，每個上室加100 μL（每孔7 000 個），下室分別加入600 μL 的完全培養基，再培養48 h 后取出小室，PBS 洗滌后在4%的多聚甲醛和0.1%的結晶紫中分別浸泡15 min，PBS洗滌后倒置放在吸水濾紙上，晾干表面水分，高倍鏡下觀察侵襲細胞數并拍照。

1.8 Western blot 實驗

用RIPA 于冰上裂解各組細胞，提取蛋白并對各組蛋白樣品定量；蛋白樣品先電泳分離（先70 V，30 min，再120 V，60 min），后 電 轉 至PVDF 膜 上（250 mA，120 min）；PVDF 膜用牛奶封閉120 min后，放入配好的一抗稀釋液中于4 ℃環境下孵育過夜（稀釋比例分別為：Vimentin 1∶20 000、E-cadherin 1∶20 000 和GAPDH 1∶5 000）。第二天取出PVDF膜，TBST 洗膜3 遍共約15 min，而后在二抗稀釋液中（稀釋比均為1∶5 000）于搖床上室溫孵育120 min，孵育結束再次洗膜，之后蘸取ECL 反應液進行曝光顯影。

1.9 統計學處理

使用Graphpad Prism 8.0 軟件對實驗結果統計分析并繪制統計圖；實驗數據用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗分析誘導實驗結果；其余實驗數據用單因素方差分析（ANOVA）檢驗比較，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 M2 型巨噬細胞的誘導與鑒定

THP-1 在誘導前懸浮生長，細胞形態呈圓形或類圓形，經PMA、IL-4 和IL-13 誘導后，細胞貼壁，形態轉為略不規則形并伸出偽足（圖1A）。經RTqPCR 檢測顯示，與未誘導的THP-1 相比，誘導后細胞中M2 型巨噬細胞的標志分子CD206 和Arg 1［13］表達升高（P＜0.05，P＜0.05），而M1 型巨噬細胞的標 志 分 子CD80 和iNOS［13，14］表 達 無 明 顯 變 化 或 略有下降（P＞0.05，P＜0.05，圖1B），這說明M2 型巨噬細胞誘導成功。

圖1 M2 巨噬細胞的誘導與鑒定Fig 1 Induction and identification of M2 macrophages

2.2 IL-10 在M2 型巨噬細胞內和M2 型巨噬細胞上清液中高表達

經RT-qPCR 和ELISA 檢測發現，與誘導前的THP-1 相 比，IL-10 在M2 型 巨 噬 細 胞 內 的mRNA水平表達升高（P＜0.05，圖2A），在上清液中的蛋白含量明顯增多（P＜0.05，圖2B）。

圖2 IL-10 在THP-1 和M2 型巨噬細胞內及上清中的表達情況Fig 2 Expression of IL-10 in THP-1 and M2 macrophages and its supernatant

2.3 M2 型巨噬細胞通過分泌IL-10 促進GBC 細胞增殖、遷移和侵襲

利用CCK-8 實驗檢測了各實驗組對細胞增殖的影響，結果顯示：NOZ 和GBC-SD 細胞在被處理48 h 和72 h 后，相較于Control 組，M2-CM 組的細胞增殖能力明顯增強（P＜0.05）；與M2-CM 組相比，M2-CM+anti-IL-10 組的細胞增殖能力顯著減弱（P＜0.05），M2-CM+IgG 組的細胞增殖能力無明顯差異（P＞0.05），見圖3。在細胞劃痕實驗中發現M2-CM 可使GBC 的細胞遷移率升高，在anti-IL-10 中和了M2-CM 中的IL-10 之后，GBC 的細胞遷移率明顯下降（P＜0.05），而IL-10 的同型對照抗體對GBC 細胞遷移率無明顯影響（P＞0.05），見圖4。Transwell實驗結果顯示M2-CM 組的侵襲細胞數明顯多于Control 組和M2-CM+anti-IL-10 組（P＜0.05），而和M2 -CM+IgG 組 相 比 無 明 顯 差 異（P＞0.05），見圖5。

圖3 M2 型巨噬細胞和IL-10 對GBC 細胞增殖的影響Fig 3 Effects of M2 macrophages and IL-10 on the proliferation of GBC cells

圖4 M2 型巨噬細胞和IL-10 對GBC 細胞遷移的影響Fig 4 Effects of M2 macrophages and IL-10 on the migration of GBC cells

圖5 M2 型巨噬細胞和IL-10 對GBC 細胞侵襲的影響Fig 5 Effects of M2 macrophages and IL-10 on the invasion of GBC cells

2.4 M2 型巨噬細胞通過分泌IL-10 促進GBC 細胞上皮間質轉化

為探明M2 型巨噬細胞和IL-10 對GBC 細胞上皮間質轉化的影響，利用Western blot 實驗檢測了E-cadherin 和Vimentin 的表達情況，結果顯示，與Control 組 相 比，M2-CM 組 上 皮 表 型E-cadherin 的 表達明顯下降，而間質表型Vimentin 的表達顯著升高（P＜0.05）；與M2-CM 組相比，M2-CM+anti-IL-10組E-cadherin 和Vimentin 的表達變化明顯被抑制（P＜0.05），M2-CM+IgG 組E-cadherin 和Vimentin 的表達水平無明顯變化（P＞0.05），見圖6。

圖6 M2 型巨噬細胞和IL-10 對GBC 細胞上皮間質轉化相關蛋白表達的影響Fig 6 Effects of M2 macrophages and IL-10 on the expression of proteins related to epithelial-mesenchymal transformation in GBC cells

3 討論

由于GBC 早期癥狀缺乏特異性且進展迅速，通?；颊叱踉\時病情已至晚期，喪失了根治性手術機會［3，15］，只能被迫接受化療、放療和靶向治療等非手術性姑息療法。雖然化療是非手術治療的首選方案［1］，但是由于化療藥無法忽視的耐藥性和全身毒性等問題，使得GBC 化療療效比較有限［16］；而GBC對放療不敏感［15］，GBC 的靶向治療目前尚未取得突出成效，5 年生存率未有得到明顯提高［17］。因此需要更加深入探究GBC 致瘤的內在機制，努力尋找更有效的分子靶點和優化治療方案，來延長患者生存期和改善患者預后。

近幾年，隨著對TME 的研究深入，針對TME所開展的抗腫瘤研究也逐漸成為了諸多學者所關注一個議題。M2 型巨噬細胞是TME 的重要組成，能夠分泌多種可溶性細胞因子，諸如TGF-β1、CCL5、CCL18 和CCL22 等［18-21］，在這些細胞因子介導下，M2 型巨噬細胞可推動腫瘤細胞惡性進展或抑制抗腫瘤免疫應答，進而實現對腫瘤的塑造。阻斷這些細胞因子的功能發揮可能是切斷腫瘤相關巨噬細胞與癌細胞之間相互聯系的一個新思路。在本實驗中筆者發現，IL-10 在M2 巨噬細胞的mRNA 水平高表達，以及在其上清液中明顯增多，所以推測IL-10 可能是M2 巨噬細胞發揮促癌能力的重要媒介。

越來越多的數據表明，IL-10 可參與多種腫瘤的生長與進展，IL-10 或可作為抗腫瘤治療的一個靶點。有文獻指出，在腫瘤細胞和腫瘤相關巨噬細胞中IL-10 的表達上調可作為癌癥分期和轉移潛力進展的預測指標［7］。此外IL-10 還可增強腫瘤細胞的干性和轉移能力。比如，Zhang 等［22］研究指出，IL-10 可以通過升高KPNA2 表達促進神經膠質瘤細胞的增殖和侵襲；另有文獻表明，IL-10 介導了人類白細胞抗原-E 對神經母細胞瘤細胞遷移和侵襲能力的增強調控［23］；在胃癌、肺癌和膀胱癌中，M2 型巨噬細胞來源的IL-10 促進了腫瘤細胞的惡性進展［24-26］。IL-10 除了在細胞層面體現了它作為分子靶標的潛力，也在動物水平的研究中證明了它在臨床治療中的可能價值。Gordy 等［27］研究表明，在黑色素瘤模型中，IL-10 中和抗體以依賴于Ⅰ型干擾素活性的方式增強了MIP3α-gp100DNA 疫苗的抗癌效果。為探明IL-10 在GBC 中的作用，本實驗用M2 型巨噬細胞上清液和IL-10 中和抗體處理GBC細胞，結果顯示M2 型巨噬細胞對GBC 細胞的增殖、遷移和侵襲有促進作用，而阻斷IL-10 后，M2 型巨噬細胞的這一促進效應明顯減弱。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是一種癌細胞上皮樣狀態喪失轉而獲得間質表型的可塑性過程，此轉化過程可使得腫瘤細胞的轉移能力獲得提升［20］。多項實驗研究發現，M2 型巨噬細胞可以誘導腫瘤細胞的EMT，例如，有實驗證明M2 型巨噬細胞在腎細胞癌中可通過分泌CXCL13 促進腫瘤細胞遷移、侵襲和EMT［28］；在肺鱗狀細胞癌中，M2 型 巨 噬 細 胞 通 過 釋 放TGF-β 激 活Smad/ZEB 通路促進癌細胞EMT［29］；Chen 等［30］研究發現，在CCL2/AKT/β-catenin 通路介導下M2-CM 可激發三陰性乳腺癌細胞的EMT。而在本實驗中也得到了相似結果，M2 型巨噬細胞可下調GBC 細胞Ecadherin 的表達以及上調Vimentin 的表達，中和IL-10 后，EMT 相關蛋白表達的這一變化明顯被抑制。

綜上所述，本研究發現M2 型巨噬細胞通過分泌IL-10 促進GBC 細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化，揭示了M2 型巨噬細胞對GBC 細胞功能調控的分子機制，為GBC 的精準治療提供了新的理論依據。

作者貢獻度說明：

趙向陽：實驗構思、實驗實施、實驗數據統計分析和文章撰寫；江博文、陶滔：協助部分實驗實施和實驗數據統計分析；談燚：實驗指導和文章批改。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。