鐵蓄積大鼠食管黏膜組織差異表達(dá)基因的篩選及生物學(xué)功能分析

劉國(guó)紅，任雨軒，邵謙毅，梁碩，王麗萍

1 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，鄭州 450001；2 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

食管癌是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，位居全球所有惡性腫瘤發(fā)病率的第6 位及致死率的第4位［1］。鐵是人體所必須的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，具有多種生物學(xué)功能，參與多種物質(zhì)代謝及DNA 合成過(guò)程，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及分裂。正常情況下，機(jī)體內(nèi)鐵水平處于平衡狀態(tài)，但攝入過(guò)量的鐵或鐵代謝相關(guān)基因突變引發(fā)鐵代謝紊亂后，體內(nèi)的鐵含量超過(guò)機(jī)體對(duì)鐵的利用和排泄能力，可引發(fā)鐵蓄積［2-3］。隨著對(duì)鐵蓄積的研究深入，發(fā)現(xiàn)鐵蓄積與癌癥等疾病的發(fā)生關(guān)系密切［4-7］。鐵離子參與催化自由基和過(guò)氧化反應(yīng)，可損傷細(xì)胞代謝和分裂能力，以致發(fā)生組織癌變。相關(guān)臨床流行病學(xué)研究曾表明，食管癌高發(fā)地區(qū)的飲用水與糧食中的鐵元素含量超標(biāo)［8-9］，故我們推測(cè)鐵蓄積可能與食管癌的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。本研究通過(guò)制備大鼠鐵蓄積模型，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選差異表達(dá)基因，并進(jìn)行生物學(xué)功能分析，以期從中篩選出與食管癌發(fā)生相關(guān)的基因與通路，從而一定程度上論證鐵蓄積與食管癌發(fā)生之間的關(guān)系，為食管癌防治提供新的思路與靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、蔗糖鐵注射液及主要試劑 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠12 只，6 周齡，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。蔗糖鐵注射液購(gòu)于鄭州大學(xué)醫(yī)院（產(chǎn)品批號(hào)21201214161）。普魯士藍(lán)購(gòu)自阿拉丁公司，多聚甲醛購(gòu)于Solarbio 公司，戊巴比妥鈉購(gòu)于天馳生物有限公司。

1.2 大鼠分組及鐵蓄積模型制備、制模成功鑒定12 只大鼠隨機(jī)分為鐵蓄積組和對(duì)照組，每組6 只。鐵蓄積組大鼠腹腔注射蔗糖鐵溶液［體積分?jǐn)?shù)為0.02 mgFe/mL，體積為525 μL×體質(zhì)量（g）/200（g）］制備鐵蓄積模型，對(duì)照組注射等體積生理鹽水，隔天1 次，共14 周。所有動(dòng)物均自由飲食。制模成功判定：①血清鐵蛋白、鐵、鐵蛋白飽和度、總鐵結(jié)合力、不飽和鐵結(jié)合力及體質(zhì)量：于末次注射后次日，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，靜止30 min，3 000 r/min 速度離心10 min，吸取血清裝入EP管。采用分光光度法（亞鐵嗪比色法）檢測(cè)血清鐵，化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)鐵蛋白，比色法檢測(cè)總鐵結(jié)合力，根據(jù)公式：不飽和鐵結(jié)合力（μmol/L）=總鐵結(jié)合力-血清鐵（μmol/L），轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度（%）=鐵（μmol/L）/總鐵結(jié)合力（μmol/L）×100，計(jì)算得出不飽和鐵結(jié)合力與轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。另記錄實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠體質(zhì)量。鐵蓄積組及對(duì)照組血清鐵蛋白水平分別為（0.495 0 ± 0.058 0）、（0.356 7 ± 0.037 3）ng/mL，鐵水平分別為（43.700 ±9.409）、（29.000 ± 2.153）μmol/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度分別為56.420% ± 11.600%、31.730% ± 3.259%，總鐵結(jié)合力分別為（77.500 ± 4.790）、（91.850 ±6.700）μmol/L，不飽和鐵結(jié)合力分別為（33.800 ±9.480）、（62.850 ± 7.504）μmol/L，兩組比較，P均＜0.05。鐵蓄積組及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)體質(zhì)量分別為（186.5 ± 7.3）、（192.7 ± 6.02）g，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量分別為（412.5 ± 26.8）、（509.5 ± 49.3）g，兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量比較，P＜0.05。以上結(jié)果提示鐵蓄積大鼠模型造模較為成功，且鐵蓄積可能導(dǎo)致大鼠的主要器官不同程度的鐵死亡，導(dǎo)致消化吸收功能受到影響，進(jìn)而使體質(zhì)量下降。②肝組織和食管黏膜組織普魯士藍(lán)染色：腹主動(dòng)脈取血后，取部分肝組織、部分食管黏膜組織，4%多聚甲醛固定后、常規(guī)石蠟包埋。切片厚度4 μm，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水水洗1 min，切片進(jìn)行普魯士藍(lán)染色15～30 min，蒸餾水充分沖洗5～10 min，入伊紅染色液，淡染細(xì)胞核15～30 s，自來(lái)水沖洗1～5 s，常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。鐵蓄積組大鼠肝臟有明顯藍(lán)色顆粒，即為鐵蓄積，而食管壁主要為外膜有一定鐵蓄積。染色結(jié)果提示，鐵蓄積大鼠模型造模成功。

1.3 鐵蓄積大鼠食管黏膜組織差異表達(dá)基因篩選 取兩組部分食管黏膜組織，于冰上迅速剝離黏膜，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｌ崛山M大鼠食管黏膜組織總RNA，后經(jīng)mRNA 富集、雙鏈cDNA 合成、PCR 富集與文庫(kù)純化與建庫(kù)后，開(kāi)展測(cè)序分析，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由生工生物工程股份有限公司完成。測(cè)序完成后使用Trimmomatic進(jìn)行過(guò)濾得到原始數(shù)據(jù)（clean data），使用HISAT2 將原始數(shù)據(jù)與大鼠的參考基因組進(jìn)行比對(duì)，將惟一比對(duì)到基因組的基因用于差異基因表達(dá)分析，使用每千個(gè)堿基轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的碎片（TPM）法對(duì)每個(gè)樣本中基因的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用DEseq2軟件進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。顯著差異篩選條件為：q-Value≤0.05 且差異倍數(shù)|Fold-Change|≥2。

1.4 鐵蓄積大鼠食管黏膜組織差異表達(dá)基因生物學(xué)功能分析 用R 包“clusterProfiler”對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和真核生物蛋白相鄰類的聚簇（KOG）分類富集分析，獲得基因功能注釋信息，從而確定差異表達(dá)基因參與的重要生物代謝途徑。

2 結(jié)果

2.1 鐵蓄積大鼠食管黏膜組織差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 共篩選出9個(gè)差異表達(dá)基因，其中5個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和4 個(gè)表達(dá)下調(diào)基因。5 個(gè)表達(dá)上調(diào)基因包括晝夜相關(guān)轉(zhuǎn)錄抑制因子（Ciart）、液泡蛋白質(zhì)分選因子25（Vps25）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶1（Uap1）、甲狀腺激素應(yīng)答蛋白（Thrsp）、血清解整合素-金屬蛋白酶33（Adam33），4個(gè)表達(dá)下調(diào)基因包括硫酸乙酰肝素蛋白多糖基因2（Hspg2）、過(guò)氧化物酶（Pxdn）基因、G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子4（Rgs4）基因、中心體相關(guān)蛋白2（Cep2），其中差異絕對(duì)值最大的是Ciart。

2.2 鐵蓄積大鼠食管黏膜組織差異表達(dá)基因GO功能富集分析結(jié)果 上調(diào)基因的生物過(guò)程集中在節(jié)律過(guò)程、代謝過(guò)程、行為、生物過(guò)程調(diào)節(jié)、特定位置運(yùn)動(dòng)、生物過(guò)程的負(fù)調(diào)控、生物調(diào)節(jié)、定位、細(xì)胞過(guò)程、多細(xì)胞生物過(guò)程；細(xì)胞組成主要集中在膜封閉腔、細(xì)胞器部分、細(xì)胞器、膜、細(xì)胞外區(qū)域部分、膜部分、蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞部分、細(xì)胞；分子功能主要集中在結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性、催化活性。下調(diào)基因的生物過(guò)程主要集中在解毒、刺激反應(yīng)、細(xì)胞組成或生物形成、信號(hào)、生物過(guò)程的負(fù)調(diào)控、生物過(guò)程的正調(diào)節(jié)、發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、生物過(guò)程調(diào)節(jié)、生物調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程；細(xì)胞組成主要集中在細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)組成、細(xì)胞外區(qū)域部分、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞器、膜、細(xì)胞部分、細(xì)胞；分子功能主要集中在酶調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性、分子功能調(diào)節(jié)劑、受體調(diào)節(jié)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、結(jié)合、催化活性。

2.3 鐵蓄積大鼠食管黏膜組織差異表達(dá)基因KOG分類富集分析結(jié)果 表達(dá)上調(diào)的基因中有3 個(gè)獲得功能注釋，Uap1 被注釋到細(xì)胞壁/膜/包膜生物形成，Adam33 被注釋到翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊和伴侶蛋白，Vps25 被注釋到功能預(yù)測(cè)。表達(dá)下調(diào)的基因中有2 個(gè)獲得功能注釋，Rgs4 被注釋到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，Hspg2 被注釋到翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊和伴侶蛋白。詳見(jiàn)圖1。

圖1 鐵蓄積大鼠食管黏膜組織差異表達(dá)基因KOG分類富集分析結(jié)果

3 討論

食管癌是臨床常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，食管癌主要可分為腺癌與鱗狀細(xì)胞癌兩個(gè)亞型，腺癌為最常見(jiàn)的亞型。對(duì)于食管癌治療方法有多重，包括外科手術(shù)治療及化療、放療。手術(shù)是治療食管癌的主要手段，但手術(shù)治療所引起的并發(fā)癥如食管狹窄阻塞等，極大地影響病人的生存質(zhì)量，且晚期食管癌患者單純手術(shù)治療預(yù)后不佳［10］。化療與手術(shù)聯(lián)合雖可改善預(yù)后，但化療藥物耐藥仍是一大問(wèn)題。鐵是人體所必須的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，正常情況下機(jī)體內(nèi)鐵水平處于平衡狀態(tài)，但攝入過(guò)量的鐵或鐵代謝相關(guān)基因突變引發(fā)鐵代謝紊亂后，鐵蓄積與癌癥等疾病的發(fā)生關(guān)系密切［4-7］。臨床上判定鐵蓄積的指標(biāo)主要為血清鐵蛋白，此值的量高于正常值但未及1 000 μg/L 時(shí)，可判定為鐵蓄積［11］。過(guò)量的鐵可促進(jìn)活性氧（ROS）的過(guò)度產(chǎn)生，過(guò)量的ROS 可與細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)反應(yīng)，后者主要由還原型谷胱甘肽（GSH）及超氧化物歧化酶（SOD）等組成。而此使得細(xì)胞抗氧化能力下降，可表現(xiàn)為GSH 與SOD 含量水平的下降，以及細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，造成質(zhì)膜功能與結(jié)構(gòu)的改變［12］，細(xì)胞代謝與分裂能力因此受到影響，可能造成食管黏膜組織細(xì)胞的癌變。

本研究通過(guò)建立鐵蓄積大鼠模型，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選差異表達(dá)基因并進(jìn)行GO 功能富集分析和KOG 分類富集分析，其GO 功能富集分析顯示差異基因主要參與了包括節(jié)律過(guò)程、代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、生物過(guò)程調(diào)節(jié)等生物過(guò)程及細(xì)胞器、膜等細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)分子活性、催化分子活性等分子功能，KOG 分類富集分析顯示共有5 個(gè)差異基因獲得KOG 功能注釋，包括翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和伴侶蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。本研究篩選出的差異表達(dá)基因中，Ciart 參與細(xì)胞晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)，在晝夜節(jié)律中，腦和肌肉芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)樣蛋白1 基因（Bmal1）與哺乳動(dòng)物時(shí)鐘節(jié)律調(diào)節(jié)因子（Clock）形成復(fù)合物，其可間接負(fù)調(diào)控多種細(xì)胞周期蛋白，參與正常的細(xì)胞周期。而Ciart 可抑制Bmal1、Clock 復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄激活，從而破壞原有晝夜節(jié)律及細(xì)胞周期，進(jìn)而使細(xì)胞異常增殖［13-14］；Thrsp 是脂質(zhì)合成所必需的，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，需要更多的脂肪酸，Thrsp高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)的合成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［15］；Uap1 是己糖胺生物合成途徑（HBP）中的關(guān)鍵酶，在多種癌癥中都發(fā)現(xiàn)了HBP 途徑的增強(qiáng)，被認(rèn)為有利于腫瘤細(xì)胞的增殖［16-18］；Adam33 具有蛋白水解酶活性，可調(diào)節(jié)整合素依賴性細(xì)胞黏附與細(xì)胞遷移，有研究認(rèn)為其與腫瘤細(xì)胞的侵襲，遷移有關(guān)［19］。這些上調(diào)基因涉及細(xì)胞周期、代謝以及增殖、遷移能力，其上調(diào)極有可能使食管黏膜組織細(xì)胞發(fā)生癌變。下調(diào)基因中，Pxdn 編碼過(guò)氧化物酶，其可與ROS 中和，起到抗氧化作用［20］，而在本實(shí)驗(yàn)鐵蓄積模型中Pxdn 基因的下調(diào)可能會(huì)進(jìn)一步加劇細(xì)胞抗氧化能力的削弱，從而與鐵蓄積所致的ROS 增多相互影響，進(jìn)一步加重膜損傷。剩余差異表達(dá)基因在癌癥發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中的作用少有文獻(xiàn)闡釋，但通過(guò)上述5 個(gè)差異表達(dá)基因的功能，我們有理由認(rèn)為其余差異表達(dá)基因亦可能在癌癥，特別是鐵蓄積致食管癌發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。

總之，鐵蓄積大鼠食管黏膜組織中共篩選出9個(gè)差異表達(dá)基因，包括5個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和4個(gè)表達(dá)下調(diào)基因。差異表達(dá)基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括節(jié)律過(guò)程、代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、生物過(guò)程調(diào)節(jié)等。有5 個(gè)差異基因獲得KOG 功能注釋，包括翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和伴侶蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要參與細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激等通路。