馬鞭草治療血瘀型閉經(jīng)的作用機制

馮君 陳西婭 程力

摘要：目的 探討馬鞭草治療血瘀型閉經(jīng)的作用機制。方法 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選馬鞭草有效成分，在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測，在GeneCards、DrugBank、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索閉經(jīng)相關(guān)疾病靶點，借助STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，在Metascape數(shù)據(jù)庫進行生物富集分析，利用AutoDockVina、Ligplot、PyMOL軟件進行分子對接。結(jié)果 保留馬鞭草有效成分7種，藥物靶點213個，60個與閉經(jīng)相關(guān)，疾病靶點2350個。GO富集涉及核雌激素受體結(jié)合等307條生物學(xué)過程；KEGG富集涉及內(nèi)分泌抵抗等43條信號通路。分子對接顯示，馬鞭草核心有效成分槲皮素、木犀草素、香葉木素、山奈酚、蒿黃素與核心靶點AKT1、EGFR、SRC、IGF1R、MMP9均有較強的結(jié)合能力。結(jié)論 馬鞭草可能作用于內(nèi)分泌抵抗等多條信號通路，通過抗炎、抗氧化、降解卵泡細胞外基質(zhì)、促進卵泡血管重塑、誘導(dǎo)原始卵泡活化等作用治療血瘀型閉經(jīng)。

關(guān)鍵詞：馬鞭草；閉經(jīng)；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接

閉經(jīng)主要表現(xiàn)為無月經(jīng)或月經(jīng)停止，增加了女性發(fā)生應(yīng)激性或脆性骨折的風(fēng)險，18歲以前出現(xiàn)的功能性下丘腦性閉經(jīng)還會不可逆地損害峰值骨量，影響成年后最終身高和骨成熟度[1]。中藥馬鞭草性味苦、涼，歸肝、脾經(jīng)，有活血散瘀、清熱解毒之功，主治癥瘕積聚、痛經(jīng)經(jīng)閉。《本草撮要》記載：“馬鞭草味苦微寒，入足厥陰經(jīng)，功專破血通經(jīng)”。現(xiàn)代藥理研究表明，馬鞭草主要化學(xué)成分揮發(fā)油、黃酮等具有抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，臨床多用于治療支氣管哮喘、肝癌等，少有用于治療閉經(jīng)者[2]。本研究簡要探討馬鞭草治療血瘀型閉經(jīng)的作用機制。

1資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

以“馬鞭草”為關(guān)鍵詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索后，導(dǎo)入SwissADME平臺篩選胃腸道吸收為“High”，且符合類藥性五原則（DL YES≥2；0 violation）的化合物，導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測；以“Amenorrhea”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards、DrugBank、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索得到疾病靶點，獲取二者的交集靶點。

將有效成分、交集靶點導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件篩選出核心有效成分；將交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進行拓撲分析，篩選核心PPI網(wǎng)絡(luò)后保留度值前10的基因為關(guān)鍵基因。

將關(guān)鍵基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫進行生物富集分析，篩選P值較小的前20個通路作圖；將有效成分、關(guān)鍵基因、KEGG通路信息導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，篩選度值排序前5的靶點為核心靶點。

1.2 分子對接

分別在TCMSP、PDB數(shù)據(jù)庫中獲取核心有效成分、核心靶點的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入AutoDockVina軟件進行半柔性對接，篩選生成氫鍵結(jié)合能最低的5組對接關(guān)系通過PyMOL、Ligplot軟件構(gòu)建對接模式圖。

2結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

保留有效成分7種（表1）、疾病靶點2350個、藥物靶點213個，交集靶點60個。導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，篩選出槲皮素、山奈酚、木犀草素、香葉木素、蒿黃素為核心有效成分；將導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1A），篩選核心PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1B），推測EGFR、SRC、IGF1R、AKT1、ESR1、MMP9、SIRT1、PARP1、PTGS2、AR可能在馬鞭草治療血瘀型閉經(jīng)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

將關(guān)鍵基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫進行生物富集分析。KEGG富集主要涉及內(nèi)分泌抵抗等43條信號通路；GO富集分析主要涉及一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性等307條生物學(xué)過程，其中富集在內(nèi)分泌抵抗信號通路上的基因顯著性最高。導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，篩選出AKT1、EGFR、SRC、IGF1R、MMP9可能是核心作用靶點。

2.2 分子對接

核心有效成分與核心靶點均能有效結(jié)合，其中槲皮素、木犀草素、香葉木素與MMP9，山奈酚、蒿黃素與AKT1生成氫鍵結(jié)合能最低（表2），對接關(guān)系模式圖顯示，5組對接關(guān)系中的有效成分與靶點均通過形成氫鍵以及疏水作用力相互作用。

3討論

閉經(jīng)病名首見于《內(nèi)經(jīng)》，古稱“女子不月”、“月事不來”等，脾腎虧虛、血虛血瘀、痰濕阻滯均可導(dǎo)致本病，以“虛則補而通之，實則瀉而通之”為基本治則。血瘀型閉經(jīng)又分為氣滯血瘀、寒凝血瘀兩種證型。現(xiàn)代藥理研究表明，馬鞭草總黃酮可通過抑制AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)細胞自噬來抑制肝癌細胞增殖，但少有針對馬鞭草治療閉經(jīng)的藥理學(xué)研究[3～4]。

研究發(fā)現(xiàn)，卵泡膜細胞和卵巢顆粒細胞的細胞外基質(zhì)（ECM）及卵泡液中存在大量明膠蛋白、纖維蛋白和 IV型膠原蛋白等，這些活性蛋白的有效水解能夠改變卵泡發(fā)育的微環(huán)境，有利于卵泡細胞增殖、遷移、分化[5]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）屬于金屬蛋白酶超家族，后者是一個多結(jié)構(gòu)域鋅依賴的內(nèi)肽酶家族。MMPs的表達可被絲裂原活化蛋白激酶、p38、粘著斑激酶、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1或蛋白激酶B（AKT）的磷酸化而改變的細胞信號所誘導(dǎo)，并傾向于與炎癥、免疫細胞滲透和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[6]。MMPs包含23個家族成員，其中基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）均屬于明膠酶，二者結(jié)構(gòu)域相似，均含有3個重復(fù)的纖維連接蛋白Ⅱ型模塊結(jié)構(gòu)域，能在體外裂解ECM蛋白，從而促進胚胎生長和發(fā)育、組織重塑、炎癥和傷口愈合，磷酸化的AKT還可誘導(dǎo)AKT依賴性FOXO蛋白磷酸化并從細胞核內(nèi)移除，觸發(fā)原始卵泡活化[7～8]。

本研究保留7種有效成分，60個交集靶點，核心有效成分是槲皮素、木犀草素、香葉木素、山奈酚、蒿黃素，核心靶點是AKT1、EGFR、SRC、IGF1R、MMP9。分子對接結(jié)果顯示，核心有效成分與核心靶點均能較好地結(jié)合，其中槲皮素、木犀草素、香葉木素與MMP9，山奈酚、蒿黃素與AKT1生成氫鍵結(jié)合能最低。由此可見，ECM蛋白水解失調(diào)、血管重塑失敗、原始卵泡活化受阻均可導(dǎo)致卵泡生長受限，最終導(dǎo)致閉經(jīng)的發(fā)生，提示MMP9、AKT是本病的關(guān)鍵治療靶點。本研究通過生物富集分析得到43條通路和307個生物學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)KEGG主要與內(nèi)分泌抵抗等信號通路有關(guān)，且內(nèi)分泌抵抗信號通路上富集的基因顯著性最高（P值最小），提示該條信號通路可能是馬鞭草治療血瘀型閉經(jīng)的關(guān)鍵信號通路。

綜上所述，馬鞭草主要成分槲皮素、木犀草素、香葉木素、山奈酚、蒿黃素作用于AKT1、EGFR、SRC、IGF1R、MMP9等基因靶點，參與多種生物學(xué)過程，調(diào)控內(nèi)分泌抵抗等多條信號通路，可通過抗炎、抗氧化、降解卵泡細胞外基質(zhì)、促進卵泡血管重塑、誘導(dǎo)原始卵泡活化等作用治療血瘀型閉經(jīng)。

參考文獻：

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