鼻咽癌組織中SUMO2、TRIM21表達及臨床預后意義*

商勝利,姚雅君,陳 明

1.開灤總醫院耳鼻咽喉頭頸外科,河北唐山 063000;2.開灤總醫院唐家莊醫院五官科,河北唐山 063100;3.唐山市第三醫院耳鼻咽喉科,河北唐山 063100

鼻咽癌(NPC)是頭頸部高發惡性腫瘤,具有位置隱匿、發展快及易轉移等特點,多數患者確診時已為中晚期,5年生存率僅為40%～50%[1]。NPC的早期診治,對于提高治療效果,延長患者生存預后,具有重要意義。泛素樣小分子修飾因子2(SUMO2)是小泛素樣修飾物蛋白家族成員,參與蛋白翻譯后修飾,與核轉運、轉錄調節、細胞凋亡等多種細胞過程密切相關[2]。有研究發現,SUMO2在胃癌[3],肝癌[4]等惡性腫瘤中表達上調,促進NOP2/Sun RNA甲基轉移酶家族成員2的表達,導致腫瘤過度增殖及侵襲。三結構域蛋白家族成員21(TRIM21) 屬于三重基序家族成員,具有E3泛素連接酶活性,通過泛素化下游靶蛋白,調節天然免疫反應、細胞周期等生物學過程[5]。研究表明,TRIM21能夠介導抗增殖蛋白1泛素化降解,激活核因子κB活性,促進NPC腫瘤細胞的增殖及遷移,是潛在的NPC腫瘤標志物[6]。目前NPC中SUMO2、TRIM21的表達及臨床預后價值尚不明確。本研究檢測NPC組織中SUMO2、TRIM21的表達,探討兩者與臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2018年2月期間在開灤總醫院(下稱本院)診治的96例NPC患者作為研究對象。其中,男59例,女37例;年齡33～78歲,平均(64.12±7.54)歲;既往有吸煙史40例,無吸煙史56例;病理類型:角化性鱗狀細胞癌20例,分化型非角化性28例,未分化型非角化性48例;臨床分期:Ⅰ～Ⅱ期32例,Ⅲ～Ⅳ期64例;腫瘤分化程度:高/中分化程度54例,低分化程度42例;淋巴結轉移:有43例,無53例。納入標準:(1)經病理活檢組織學檢查診斷為NPC;(2)初發且初次診治,確診后于本院接受放化療治療;(3)臨床資料完整。排除標準:(1)NPC復發患者;(2)合并其他器官嚴重疾病患者;(3)因自身原因放棄或中斷治療患者;(4)合并精神障礙性疾病患者。

本研究符合赫爾辛基宣言原則,并經本院倫理委員會審核通過。患者及家屬已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1檢測方法 留取NPC癌和癌旁組織(距離癌組織0.5 cm以上),石蠟包埋切片。實驗步驟:70 ℃烤片1 h,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,將切片置于檸檬酸鹽溶液中,微波爐中100 ℃ 10 min,自然冷卻后,H2O2阻斷15 min,3%羊血清封閉2 h,一抗(稀釋比1∶1 000)4 ℃孵育16 h,SUMO2鼠單克隆抗體購自美國GeneTex公司,貨號GTX35096。TRIM21兔單克隆抗體購自美國Abcam公司,貨號ab207728。二抗室溫孵育1 h,DAB顯色液顯色5 min,蘇木素復染,鹽酸乙醇分化后梯度脫水封片,鏡下(日本奧林巴斯公司,型號DX31)觀察染色情況。染色強度評分:未染色為0分,淺黃色1分,棕褐色顆粒2分。染色陽性細胞百分比評分: ≤25%為1分,>25%～50%為2分,≥50%為3分。兩者的乘積為最終染色評分,≥2分定義為陽性,<2分為陰性[7]。

1.2.2治療及隨訪 所有患者確診后,均于本院接受放化療。調強放射治療:原發灶放療總劑量70 Gy,轉移淋巴結區64 Gy,每日1次,每周5次,30次完成;腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期者同時接受順鉑為基礎的誘導+同步化療或輔助化療,誘導化療方案為:化療第1日多西他賽70 mg/m2(太極集團四川太極制藥有限公司,國藥準字 H20103665),在第1～3天給予順鉑(齊魯制藥有限公司,國藥準字H20023461)25 mg/m2,第1～5天給予5氟尿嘧啶(悅康藥業集團有限公司,國藥準字 H11020237)500 mg/m2。每隔 21天為一個周期,總共 2～3 個周期。同期放化療:即在放療第1天開始給予順鉑100 mg/m2,每3周1次,21 d為1個周期,同期治療2個周期。NPC患者治療結束后開始隨訪,隨訪5年。隨訪間隔:第1～2年內每3個月隨訪1次,第3～5年每6個月隨訪1次,以門診和電話方式進行回訪,隨訪截止時間為2023年3月1日。終點事件為患者死亡或隨訪時間截止。

1.3統計學處理 采用SPSS25.0統計學軟件進行數據分析。計數資料采用例數或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。SUMO2、TRIM21蛋白表達相關性采用Spearman秩相關分析。繪制Kaplan-Meier曲線,不同SUMO2、TRIM21表達生存曲線比較采用Log-rank檢驗。單因素及多因素Cox回歸分析NPC預后影響因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1NPC癌與癌旁組織中SUMO2、TRIM21表達 NPC癌組織中SUMO2棕黃色陽性染色主要位于細胞核,TRIM21棕黃色陽性染色主要位于細胞質和細胞膜。NPC癌組織中SUMO2、TRIM21陽性率分別為72.92%(70/96)、75.00%(72/96),高于癌旁組織的6.25%(6/96)、7.29%(7/96),差異具有統計學意義(χ2=89.205、90.870,P<0.001、0.001)。見圖1。

圖1 癌組織與癌旁組織中SUMO2、TRIM21表達 (免疫組化,×200)

2.2NPC癌組織中SUMO2與TRIM21表達相關性 NPC癌組織中SUMO2與TRIM21蛋白表達呈顯著正相關(r=0.756,P<0.001)。

2.3癌組織中SUMO2、TRIM21表達與NPC臨床病理特征的關系 臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化程度、有淋巴結轉移NPC癌組織中SUMO2、TRIM21表達陽性率高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、高/中分化程度、無淋巴結轉移癌組織,差異有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 癌組織中SUMO2、TRIM21表達與NPC臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4癌組織SUMO2、TRIM21表達與NPC患者生存預后的關系 本研究96例NPC患者隨訪中失訪2例,死亡26例,5年生存率為72.92%(70/96)。SUMO2表達陽性及陰性組的5年生存率分別為67.14%(47/70)、88.46%(23/26),SUMO2表達陽性組5年累積生存率低于陰性組,差異有統計學意義(Log-rankχ2=4.757,P=0.029)。TRIM21表達陽性及陰性組5年生存率為66.67%(48/72),91.67%(22/24),TRIM21表達陽性組5年累積生存率低于陰性組,差異具有統計學意義(Log-rankχ2=5.303,P=0.021)。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier曲線分析SUMO2、TRIM21表達對NPC患者預后的影響

2.5Cox回歸分析NPC患者預后影響因素 以NPC患者預后為因變量(1=死亡,0=生存,t=時間),納入年齡、性別、吸煙史、腫瘤分化程度、病理類型、淋巴結轉移、臨床分期、SUMO2、TRIM21為自變量,單因素和多因素Cox回歸分析結果顯示,臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化程度、淋巴結轉移、SUMO2與TRIM21表達陽性是影響NPC預后的獨立危險因素。見表2、表3。

表2 單因素Cox回歸分析

表3 多因素Cox回歸分析

3 討 論

NPC是我國高發的惡性腫瘤之一,南方較為常見。NPC臨床表現為鼻塞、涕中帶血及頸部淋巴結腫大等癥狀,由于早期癥狀不典型,臨床上不易早期診斷。NPC解剖位置隱匿,惡性程度高,容易出現淋巴結轉移,多數患者初診時已為局部晚期[7]。放療是NPC的主要治療方式,雖然經積極放療及同步輔助化療使NPC患者臨床結局有所改善,但仍有患者可出現腫瘤復發和轉移,導致患者死亡[8]。深入研究NPC的疾病發生及機制,尋找能夠評估NPC患者預后的腫瘤標志物,具有重要意義。

小類泛素相關修飾蛋白是分子結構類似于泛素的蛋白,包括SUMO1～4四種亞型,能夠可逆性翻譯后修飾蛋白,調節蛋白穩定性[9]。SUMO2主要與應激相關靶蛋白共價結合,參與DNA損傷修復、免疫應答及細胞凋亡等過程的調控[4]。近年來有研究發現,SUMO2的表達失調能激活轉化生長因子β信號通路,促進腫瘤細胞的侵襲和遷移,導致膀胱癌等惡性腫瘤進展[10]。本研究中,NPC癌組織中SUMO2表達升高,與不良臨床病理特征有關,提示SUMO2促進NPC的腫瘤發展。NPC中SUMO2的表達與非編碼RNA調控有關。有研究發現,NPC腫瘤細胞中環狀RNA circRNF13通過與SUMO2 mRNA的3′非翻譯區結合,延長SUMO2 mRNA的半衰期,激活SUMO2蛋白表達,而SUMO2的表達上調通過促進葡萄糖轉運蛋白1的SUMO化降解,激活腫瘤細胞糖酵解途徑,促進NPC腫瘤細胞的增殖和轉移[11]。尚有研究發現,胰腺癌細胞中SUMO2通過與KRAS蛋白的賴氨酸113殘基處結合,誘導其過度激活,增強異質性胞核核糖核蛋白A1的外泌體分泌,促進腫瘤淋巴管生成和淋巴轉移的發生[12]。本研究發現,SUMO2陽性的NPC患者預后較差,提示SUMO2是新的評估NPC預后的腫瘤標志物。分析其原因,可能是SUMO2的表達能夠促進細胞DNA損傷修復,降低放化療治療的敏感性。ZHAO等[13]報道,SUMO2的表達上調通過促進細胞核中γ-肌動蛋白的SUMO化來促進DNA損傷修復并減輕心肌損傷,而沉默SUMO2的表達后則進一步加劇DNA損傷,促進細胞氧化應激損傷及凋亡。ZHANG等發現[14],乳腺癌中SUMO2的表達能夠在DNA損傷晚期促進MORC家族CW型鋅指結構蛋白2的SUMO化修飾,進而磷酸化激活DNA依賴性蛋白激酶催化亞基,促進DNA損傷修復,應用SUMO2抑制劑后能增加乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性。因此,SUMO2的表達促進NPC的發生發展,是NPC患者不良預后的腫瘤標志物,SUMO2可能是潛在的NPC腫瘤治療靶點。

TRIM21是TRIM家族成員,又稱為Ro52,含有RING鋅指、B盒及卷曲螺旋三個結構域,參與干擾素調節轉錄因子的泛素蛋白酶體途徑降解,調節機體天然抗病毒免疫反應[15]。有研究發現,TRIM21能夠通過泛素化細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27,促進細胞周期的進展,導致腫瘤過度增殖[16]。本研究中,NPC癌組織中TRIM21表達升高,與臨床分期、分化程度及淋巴結轉移有關,提示NPC中TRIM21的表達上調促進腫瘤的惡性進展。NPC中TRIM21表達上調與表達調控失調有關。有研究發現,NPC中WD重復結構域磷酸肌醇相互作用表達缺失,導致其不能結合并抑制TRIM21的表達及功能,抑制腫瘤細胞自噬,進而促進腫瘤的增殖、侵襲及轉移[17]。此外,TRIM21還能夠通過介導小G蛋白信號調節因子1的泛素化和蛋白降解,激活絲裂原活化蛋白激酶通路,促進NPC腫瘤細胞的侵襲和轉移[18]。本研究中,TRIM21表達與NPC患者不良預后有關,提示檢測NPC癌組織中TRIM21的表達能夠評估NPC患者的生存預后。分析其原因,可能是TRIM21的表達能夠增強腫瘤細胞對放化療治療的抵抗性。ZHANG等[19]報道,電離輻射后,TRIM21通過介導Serpin家族B成員5的泛素化降解,抑制鳥嘌呤單磷酸合成酶進入細胞核,抑制TP53的表達,從而保護NPC細胞免受輻射介導的細胞凋亡。此外,NPC中TRIM21的表達能夠促進線粒體電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白2的泛素化降解,釋放線粒體DNA,抑制輻射暴露后的I型干擾素反應,降低NPC細胞的抗原呈遞能力及細胞毒性T細胞介導的抗腫瘤免疫[20]。

本研究中,NPC癌組織中SUMO2與TRIM21蛋白表達呈正相關,提示兩者可能存在協同作用。有研究發現,結直腸癌中TRIM21的表達受SUMO化修飾的調節,腫瘤細胞中較高的SUMO化水平能上調TRIM21表達,促進POU 2類同源盒1泛素化降解,增強腫瘤細胞干細胞特性,增強化療及放療治療抵抗性,促進腫瘤轉移和復發[21]。因此,SUMO2與TRIM21在NPC中可能發揮協同促癌的生物學作用,值得深入研究。

綜上所述,NPC中SUMO2、TRIM21表達升高,兩者與NPC不良臨床病理特征有關,均能促進NPC的腫瘤進展。SUMO2,TRIM21陽性的NPC患者預后較差,是新的評估NPC預后的腫瘤標志物,輔助臨床醫生對NPC患者進行診治。本研究的不足在于樣本量有限,未能對不同NPC亞型進行分層研究,有待今后擴大樣本量深入研究二者在NPC中的作用機制。