創傷性膝骨關節炎患者血清CX3CL1、Apelin-13與炎癥指標的相關性及預后價值

呂新凱,李光磊,段強民,王寶鵬,張 平,孫全省,張 冰

山東省淄博市臨淄區人民醫院骨科一病區,山東淄博 255400

骨關節炎(OA)多發于負重關節,是一種退行性的關節病,主要特征為關節軟骨退化[1]。創傷性膝骨關節炎(PTOA)是繼發關節損傷后的并發癥,約占OA的12%,常見于踝關節和膝關節,有研究發現,PTOA患者比其他類型的OA患者年輕約10.4歲[2]。隨著社會生活節奏的加快,交通意外及運動損傷逐漸增多,PTOA的發病率也在逐年升高,所以加強對PTOA發生與發展過程的研究對于PTOA的臨床診斷及治療具有重要意義。有研究發現,炎癥介質的產生在OA的發病進程中能發揮關鍵作用,OA的影像分級與血清中多種炎癥標志物有關[3]。

CX3CL1是一種具有促炎反應功能及趨化功能的跨膜糖蛋白。CX3CL1以可溶或者膜結合兩種形式存在,具有趨化性和黏附的兩重屬性[4]。CX3CL1可以進行單核細胞募集和活化T淋巴細胞,從而釋放促炎抑制參與多種疾病的炎癥反應過程[5]。脂肪細胞因子(Apelin)屬于人G蛋白受體的內源性配體,Apelin-13是Apelin家族成員中的一員,Apelin在人成骨細胞中也有表達,有研究顯示,Apelin基因敲除的小鼠,骨礦化及骨形成的程度均加深,Apelin可能與關節軟骨的代謝過程相關,且骨損害越嚴重的糖尿病患者血清Apelin-13的表達水平越低[6-7]。通過文獻查閱CX3CL1與Apelin-13可能均與PTOA的發生相關,目前關于血清CX3CL1與Apelin-13在PTOA的表達水平的報道尚不多見,本文對PTOA患者血清CX3CL1與Apelin-13的表達水平進行探討,并分析二者與炎癥指標的相關性及患者預后的價值,以期為探索PTOA的治療方法及發病機制提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2022年2月在本院確診的65例PTOA患者作為試驗組,其中男35例,女30例,平均年齡(55.46±6.68)歲;另選取同期于本院健康體檢的55例體檢健康者作為對照組,其中男28例,女27例,平均年齡(54.62±6.75)歲。試驗組納入標準:(1)符合《骨關節炎診斷及治療指南》中PTOA診斷標準[8],影像學檢驗證實存在膝骨關節炎。(2)患者均有膝關節創傷史,膝關節腫脹、疼痛、腿部屈伸是存在阻礙,膝關節活動時有摩擦音。(3)膝關節邊緣存在不同程度的骨刺,軟骨下關節面硬化。試驗組排除標準:(1)類風濕性關節炎、痛風、膝蓋損傷、糖尿病、化膿性關節炎及非創傷性關節炎者;(2)有傳染性疾病者。對照組納入標準:(1)年齡>18歲;(2)意識清晰,依從性良好,身體健康。本研究經過本院的倫理委員會批準,所有受檢者均詳細知曉本研究內容并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1主要試劑及儀器 CX3CL1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海酶聯生物科技公司,Apelin-13 ELISA試劑盒購自上海科艾博生物公司,白細胞介素-6(IL-6)、瘦素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(貨號:SP10234、SP10126、SP10205)購自武漢塞培生物科技有限公司、降鈣素原(PCT)試劑盒(貨號:231465)購自上海凱創生物技術有限公司、超敏C反應蛋白(hsCRP)試劑盒(貨號:06522059)購自上海西門子醫學診斷產品有限公司,DW-86L828J,超低溫冰箱購自弘林科學儀器公司,PHOMO型酶標儀購自貝登醫療有限公司,OLMPUS AU2700全自動生化分析儀及化學發光分析儀購自萬孚生物公司,QD-S300免疫熒光分析儀購自南京諾唯贊醫療科技有限公司,牛頓光學(Newtonoptic)CytoEasy全自動高通量細胞計數儀分析儀購自昊擴科器公司。

1.2.2標本采集及實驗方法 所有受試者均需要禁食10 h,于次日清晨采集空腹靜脈血4 mL,取1.5 mL血液樣本,采用牛頓光學細胞計數儀檢測白細胞計數(WBC),將3.5 mL轉移至高速離心機內,2 500 r/min離心10 min,離心半徑為10 cm,吸取試管中最上層的血清置于超低溫冰箱待用。

使用ELISA試劑盒檢測血清中IL-6、瘦素、TNF-α、CX3CL1與Apelin-13的表達水平,試驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行,采用免疫化學發光法檢測PCT表達水平,采用免疫散射比濁法測定hsCRP表達水平。

1.2.3隨訪及預后評定 對所有患者出院后進行為期1年的隨訪,隨訪方式主要為門診復查,并對最后一次隨訪時的膝關節功能進行記錄,隨訪截止時間為2023年2月28日。依據膝關節功能評分標準[9],將PTOA患者分為預后不良組39例(<70分),預后良好組26例(70～100分)。

2 結 果

2.1PTOA患者一般資料、炎癥指標與血清CX3CL1和Apelin-13的表達水平情況 兩組在性別及年齡方面比較,差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比,試驗組中的炎癥指標IL-6、瘦素、PCT、hsCRP、TNF-α、WBC均呈上升趨勢,其中IL-6、瘦素、PCT、hsCRP、TNF-α的表達水平顯著升高,差異具有統計學意義(P<0.05),試驗組中血清CX3CL1的表達水平顯著升高,Apelin-13的表達水平顯著下降,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 PTOA患者一般資料、炎癥指標與血清CX3CL1和Apelin-13的表達水平情況 [n(%)或

2.2血清CX3CL1和Apelin-13與炎癥指標相關性分析 Pearson法相關性分析顯示,CX3CL1與IL-6、瘦素、TNF-α呈正相關(r=0.528、0.526、0.602,P<0.001)。Apelin-13與IL-6呈負相關(r=-0.541,P<0.001)。見表2。

表2 血清CX3CL1和Apelin-13與一般炎癥指標相關性分析

2.3不同預后炎癥指標與血清CX3CL1和Apelin-13的表達情況 對患者進行為期1年的隨訪,結果顯示,預后不良發生率為60.00%。與預后良好組相比,預后不良組的IL-6、瘦素、PCT、hsCRP、TNF-α及CX3CL1的水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05),Apelin-13的表達水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同預后炎癥指標與血清CX3CL1和Apelin-13的表達情況

2.4血清CX3CL1與Apelin-13預測PTOA預后不良的診斷價值分析 ROC曲線結果顯示,血清CX3CL1和Apelin-13水平預測預后不良的AUC分別為0.759(95%CI:0.637～0.857)、0.806(95%CI:0.689～0.893);截斷值分別為135.04 pg/mL、19.66 ng/L;CX3CL1靈敏度為87.2%,特異度為80.8%;Apelin-13靈敏度為92.3%,特異度為84.6%;血清CX3CL1和Apelin-13聯合預測的AUC為0.893(95%CI:0.791～0.956),靈敏度為97.4%,特異度為76.9%。與血清CX3CL1和Apelin-13單獨指標相比,CX3CL1聯合Apelin-13檢測預后不良的AUC較高(Z聯合-CX3CL1=2.010,P=0.044;Z聯合-Apelin-13=2.091,P=0.036),見表4。

表4 血清CX3CL1與Apelin-13預測PTOA預后不良的診斷價值分析

2.5多元Logistic回歸分析PTOA預后不良的影響因素 以PTOA預后不良為因變量,以表3中有差異的因素及血清CX3CL1與Apelin-13進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示IL-6、瘦素、TNF-α、CX3CL1與Apelin-13是PTOA預后不良的影響因素(P<0.05)。見表5。

表5 PTOA預后不良的多元Logistic回歸分析

3 討 論

PTOA的主要病理變化表現為創傷引起患者關節軟骨退化變性及繼發性的骨質增生,主要臨床表現為活動障礙,關節疼痛,疾病進一步發展可導致患者殘疾,對患者的日常生活及心理造成嚴重傷害[10-11]。PTOA的致病機制可以分為三個階段,第一階段是即時階段,與膝關節損傷期間和之后的病理機械負荷有關,第二階段直接發生在即時階段之后,并持續到受傷后的幾周之內。這一階段的特征是急性炎癥期,這一時期會發生細胞外基質碎裂,細胞死亡和在某些情況下的關節積血。這個階段可以在幾個月后自行消退,也可以持續并進展到第三階段,其慢性炎癥狀態伴滑膜炎,最終導致PTOA的發生與發展[12]。越來越多的研究表明炎癥在PTOA的發展中發揮著關鍵作用,炎癥可能會因為患者關節積血而進一步加重患者病情[13-15]。為了更好的治療患者,開發抗炎療法是PTOA患者臨床治療及預后的新方向,本研究就PTOA患者血清中CX3CL1與Apelin-13的表達水平進行探索,以期能為PTOA的預后及病理生理機制分析提供幫助。

CX3CL1是一種獨特的趨化因子,表現為跨膜蛋白,經過蛋白水解處理可以產生可溶性趨化因子。CX3CL1包含373個氨基酸長度,具有N端趨化因子結構域(含有77個氨基酸受體結合的結構域)。CX3CL1分子在細胞膜受到各種脫落酶的切割,例如,金屬蛋白酶結構域的蛋白10(ADAM10)、腫瘤壞死因子-α轉換酶(TACE),其能夠在炎癥反應期間誘導TNF-α并將其加工成活性形式[16]。CX3CL1在神經元中產生,最初被翻譯為跨膜蛋白,可以通過蛋白水解產生可溶性趨化因子,CX3CL1通過其唯一的受體CX3CR1釋放信號,CX3CR1位于中樞神經系統(CNS)內的小膠質細胞上,盡管CX3CL1的膜結合形式與可溶性形式都與CX3CR1相互作用,但它們具有不同的信號轉導能力,有研究表明,CX3CL1在CNS內的主要功能是減少促炎反應,是神經的保護因素[17]。有研究顯示,CX3CR1在冠心病患者外周血T細胞中大量表達,表明在患者的冠狀動脈斑塊內發生了炎癥反應,存在于外周血T細胞中的CX3CR1被激活,進一步激活了體內T細胞,引發炎癥反應的級聯反應,加深了炎癥反應的程度[18]。本研究中PTOA患者血清CX3CR1的表達水平較對照組上升了約1.4倍,表明CX3CR1參與了PTOA發生發展期間的炎癥反應,可能是通過激活免疫反應中的T細胞引發炎癥級聯反應來加劇病情的發展。Pearson法相關性分析顯示CX3CL1與IL-6、瘦素、TNF-α呈顯著正相關,這表示CX3CL1可能是促進了炎癥因子的分泌,進一步加重了炎癥反應,后續還需擴大實驗范圍進一步研究CX3CL1在PTOA的作用機制。

Apelin是位于染色體Xq25-26.1上的多肽,由APLN基因產生,可以與G蛋白偶聯受體(APJ)發生結合,進而參與多種生理過程。依據終產物氨基酸的長度不同可以劃分出3種類型,包括Apelin-13、Apelin-17、Apelin-36,長度越短的多肽活性越強[19]。研究顯示,Apelin-13作為一種內源性肽,可以合成神經營養因子及抑制炎癥反應,具有很強的神經保護作用,給予Apelin-13注射的大鼠體內TNF-α及IL-1β的水平被抑制[20]。相關研究顯示,在2型糖尿病骨質疏松患者血清中Apelin-13表達水平下降,其可以激活骨細胞內的信號分子,促進骨細胞的增殖,骨質損傷越嚴重則Apelin-13表達水平越低[7]。在本研究中,PTOA患者血清apelin-13表達水平顯著下降,可能是因為PTOA患者體內炎性因子過多導致細胞受損,進而導致了Apelin-13的表達水平下降。與之相反,Apelin在膝骨關節炎(KOA)患者中表達水平升高,其與KOA患者膝關節局灶脂質代謝相關[21]。原因可能是Apelin-13與Apelin參與炎癥反應發揮的作用存在差異,具體原因還需要進一步探索。Apelin-13與IL-6呈負相關,表明Apelin-13對炎癥有抑制作用,這與Apelin-13在AD的作用相同,下一步將擴大樣本量驗證Apelin-13在PTOA中的表達水平并探索其在PTOA發病機制中的作用。

多元Logistic回歸分析結果顯示,CX3CL1與Apelin-13是PTOA預后不良的影響因素,說明在PTOA的發生與發展中,CX3CL1與Apelin-13可能發揮重要作用。ROC曲線下面積表明,血清CX3CL1和Apelin-13水平預測預后不良的AUC分別為0.759、0.806,均具有較好的預測價值,但二者聯合檢測的AUC更高,說明CX3CL1和Apelin-13聯合檢測PTOA預后不良的診斷價值更高,可能為PTOA的預后治療提供參考。

綜上所述,PTOA患者血清CX3CL1的表達水平顯著升高,Apelin-13的表達水平顯著下降,二者是PTOA患者預后不良的影響因素,聯合檢測CX3CL1與Apelin-13對PTOA患者預后提供幫助,CX3CL1與Apelin-13有望成為PTOA預后的潛在分子生物標志物。本研究的不足之處是未對CX3CL1,Apelin-13表達水平與PTOA發病階段進行深入研究,后期將擴大樣本量進一步分析CX3CL1與Apelin-13與PTOA的發病階段是否具有相關性,以及二者在PTOA疾病發展中的作用機制,為PTOA的預后及病理機制研究提供參考。