血漿脂肪酸乙酯與酒精性急性胰腺炎炎癥和疾病嚴重程度的相關性研究*

臧桂芹,葉 丹,孫艷艷

北京航天總醫院急診科,北京 100076

乙醇攝入過量是引起急性胰腺炎(AP)的常見原因[1],然而臨床上對酒精性急性胰腺炎(AAP)的診斷還具有挑戰性,因為它依賴于可靠的病史,尚缺乏客觀的依據來支持或反駁診斷[2]。而且乙醇在血液中的水平通常在攝入后1～2 h內達到峰值,隨后數小時內消除,因此當患者出現AAP時,通常已無法依靠乙醇檢測做出判斷[3]。乙醇本身并不會引起AP,而對于大量飲酒甚至乙醇中毒者,胰腺會通過氧化或非氧化代謝途徑降解乙醇。非氧化乙醇代謝是依靠脂肪酸乙酯合成酶來完成的,而脂肪酸乙酯(FAEE)是非酯化脂肪酸(NEFA)和乙醇的非氧化代謝物[4]。在胰腺中,脂肪酸乙酯合成酶活性相較于肝臟更高,因此非氧化途徑的乙醇代謝率也相對較高[5]。本文推測FAEE的產生可能在乙醇相關的胰腺功能障礙和AAP的發展中起著重要作用。為了證實該推斷,本研究試圖通過回顧性隊列研究調查血漿FAEE水平對AAP鑒別診斷和疾病嚴重程度的預測效能,希望尋找有效的AAP診斷生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究回顧性篩查了2017年1月至2022年1月期間本院重癥醫學科收治的227例AAP患者,以及年齡、性別相匹配的213例非酒精性AP患者(包括91例高三酰甘油血癥患者,78例膽源性患者,21例飲食不節性患者和23例非酒精性復合因素患者)。根據《中國急性胰腺炎診治指南(2021)》[6],AP被定義為特征性腹痛,血漿脂肪酶或淀粉酶水平至少增加3倍。在本研究中,納入的患者都具有急性腹痛和嘔吐臨床癥狀并伴有腹膜炎癥狀,如腹脹、腰椎肋骨壓痛和腫脹,提示腹腔滲出、炎癥和腹腔內高壓。于入院后24 h內采集所有患者的血樣,并測定血漿淀粉酶(參考值25～125 U/L)和脂肪酶(參考值23～300 U/L)活性。采用腹部CT掃描作為標準成像方法,對診斷不明確的患者進行增強CT掃描。排除標準:(1)慢性胰腺炎、內鏡下逆行胰膽管造影術后胰腺炎、壺腹周圍癌癥、導管內乳頭狀黏液性腫瘤和自身免疫性胰腺炎;(2)急慢性肝臟疾病;(3)癥狀出現后>24 h入院。AAP組患者共227例,在發病前24 h內有大量飲酒史或乙醇攝入量>80 g/d[7],其中男175例,女52例,年齡19～80歲,平均(47.23±12.71)歲。非酒精性AP組患者共213例,女性飲酒量<20 g/d,男性飲酒量<20 g/d,且所有患者均有確切病因,其中男159例,女54例,年齡19～80歲,平均(48.53±19.56)歲。本研究獲得了本院醫學倫理委員會的批準(2021倫審科字第G028號 ),該委員會因回顧性研究性質放棄了知情同意的要求。

1.2疾病嚴重程度 所有患者均采用第二代雙源CT掃描儀(Siemens Healthcare,德國)進行CT掃描。上腹部CT參數為120 kVp,200 mAs,探測器準直為64 mm×0.6 mm,螺距1.2,球管旋轉時間0.5秒/周,層厚為5.0 mm,采用標準重建算法。首先進行腹部CT掃描,然后以3～5 mL/s的流速注射造影劑,以確定胰腺壞死。根據Bathazar CT分級[8-9]評估患者的疾病嚴重程度:0～3分為輕度,>3～6分為中度、>6～10分為重度。

1.3血漿檢測 所有患者進入急診室后第一時間采集血樣,離心收集血漿后,保存在-70 ℃樣本庫中。化學試劑(分析純,≥98%)均購自美國Sigma-Aldrich試劑公司。將375 μL患者血漿(按1∶20稀釋)加入含有55 μmol/L十七烷酸乙酯的3 mL冷丙酮中作為內標。混懸10 s并離心10 min后,加入3 mL己烷提取脂質,重復提取2次。合并后在真空下干燥。將樣品在含有10 ppm咖啡因的75 μL己烷中重組,并通過Agilent 7693自動液體采樣器將1 μL樣品注入260 ℃進樣口中。采用Agilent 7890B儀器和HP-5 ms(5%苯基)-甲基聚硅氧烷超惰性色譜柱進行氣相色譜(GC),氦載氣流速保持在1 mL/min。將樣品注入色譜柱上,溫度以30 ℃/min升高至150 ℃并保持2 min,然后以4 ℃/min緩慢升至250 ℃,最后以20 ℃/min升至300 ℃并保持2 min。使用Agilent 5977A質譜儀對樣品進行定量。通過保留時間和選擇離子監測鑒定FAEE成分。FAEE檢測下限為10 nmol/L。在本院實驗室通過GC檢測血漿游離脂肪酸(NEFA)。另外,采用酶標(ELISA)儀檢測血漿中白細胞介素(IL)-1β、IL-6水平,檢測試劑盒及標準品購自Beijing Human Diagnostics公司(中國)。

2 結 果

2.1AAP組和非酒精性AP組基本資料比較 AAP組和非酒精性AP組性別、年齡、體重指數(BMI)、吸煙狀況、糖尿病或高血壓史、疾病嚴重程度及常規的實驗室檢查比較,差異無統計學意義(P>0.05)。然而,與非酒精性AP組相比,AAP組患者血漿FAEE(P<0.001)和NEFA(P=0.019)水平更高。經ROC曲線分析,血漿FAEE在鑒別診斷AAP組和非酒精性AP組患者曲線下面積(AUC)分別為0.926(95%CI:0.901～0.951)和0.515(95%CI:0.459～0.571);在最佳截斷值時,血漿FAEE≤93.50 nmol/L鑒別診斷的靈敏度和特異度分別為79.70%和90.60%。見表1、圖1。

表1 AAP組和非酒精性AP組患者臨床病理特征比較或n(%)或M(P25～P75)]

圖1 血漿FAEE和NEFA水平鑒別診斷AAP組和 非酒精性AP組患者的ROC曲線

2.2血漿FAEE水平與AAP患者臨床病理特征的相關性 根據AAP組血漿FAEE水平的中位值(146.61 nmol/L)進行亞組分層,比較2組的臨床病理特征發現,高水平亞組(>146.61 nmol/L)AAP患者年齡相對較大、重癥患者比例更高,而PLT則較低水平亞組(≤146.61 nmol/L)更低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 血漿FAEE水平與AAP患者臨床病理特征的相關性或n(%)或M(P25～P75)]

2.3AAP組血漿FAEE、NEFA水平與疾病嚴重程度的相關性 根據AAP患者的疾病嚴重程度評估,中度[158.77(127.01～230.55)nmol/L]和重度[274.49(208.32～309.31)nmol/L]患者血漿FAEE水平高于輕度患者[126.15(84.37～166.52)nmol/L],而且重度患者較中度患者更高,3組比較,差異有統計學意義(H=64.069,P<0.001)。血漿NEFA水平也隨著疾病加重而升高,輕度、中度和重度患者血漿NEFA水平比較,差異有統計學意義[1 252.78(781.25～1687.48)μmol/Lvs.1 610.70(1 092.51～2 040.78)μmol/Lvs.2 581.88(1 567.49～3 803.56)μmol/L;H=41.594,P=0.108]。

2.4單因素Logistic回歸分析重度AAP的危險因素 經單因素Logistic回歸分析血漿FAEE水平>146.61 nmol/L是重度AAP的危險因素(P<0.05),見表3。

表3 單因素Logistic回歸分析重度AAP的危險因素

2.5ROC曲線分析血漿FAEE水平對重度AAP的預測價值 血漿FAEE水平預測重度AAP時的AUC為0.786(95%CI:0.705～0.867),當血漿FAEE水平≥146.57 nmol/L時,血漿FAEE水平能以83.3%的靈敏度和62.4%的特異度預測重度AAP。見圖2。

圖2 血漿FAEE水平預測重度AAP的ROC曲線

2.6相關性分析 Spearman秩相關分析結果顯示,AAP患者血漿FAEE與IL-1β及IL-6水平呈正相關(rS=0.298、0.475,均P<0.001),見圖3A、B;此外,分析顯示其與NEFA水平呈正相關(rS=0.302,P<0.001),見圖3C。

注:A為血漿FAEE與IL-1β的相關性;B為血漿FAEE與IL-6的相關性;C為血漿FAEE與NEFA的相關性。

3 討 論

在本研究中,發現血漿FAEE水平對鑒別AAP和非酒精AP有一定效能,而且在AAP組中,隨著疾病嚴重程度的加重,患者血漿FAEE水平也逐漸升高,這提示FAEE可能與AAP疾病發生和進展相關。進一步經Logistic回歸分析和ROC曲線分析,結果顯示,血漿FAEE水平具有獨立預測重度AAP的良好效能,AUC為0.786(95%CI:0.705～0.867),靈敏度為83.3%。這些結果均支持血漿FAEE水平升高具有AAP的病理生理作用及臨床實用性。

近些年,乙醇誘發AP的發病率持續增加[10]。一般將AP 嚴重程度分為輕度、中度和重度,大多數病例為輕度,有病程自限性,通常不合并器官功能障礙,可在一周內恢復;中度AP消退較慢,存在短暫性器官衰竭;而大約25%的AP 患者出現嚴重并發癥,必須住進重癥監護病房。重度AP的病死率可達30%,迫切需要找到合適的生物標志物來輔助臨床診療[2]。FAEE已被提出可作為嬰兒產前暴露于乙醇的已知生物標志物[11],即使在沒有乙醇中毒的情況下,也會存在于酗酒者的內臟脂肪中[4]。FAEE是在乙醇存在下通過特定的脂肪酸乙酯合成酶和其他酶從三酰甘油或游離脂肪酸等中產生的。這些非氧化乙醇代謝產物可以在血液、組織和頭發中檢測到[12]。乙醇的非氧化代謝物在胰腺中形成的比任何其他單位質量的組織都多,因此,FAEE被認為是一種重要的胰腺炎毒素[13]。NEFA已被確認在人胰腺炎中升高,但是其并不能區分AAP患者和非酒精性AP患者。這種急性非酯化NEFA水平升高,是由于內臟脂肪組織壞死導致的。高NEFA可抑制線粒體復合物Ⅰ和Ⅴ,導致胰腺壞死、腎小管損傷、急性呼吸窘迫綜合征,甚至多系統器官衰竭。不同的是,在本研究中,AAP組患者血漿FAEE水平與NEFA水平呈正相關,說明乙醇代謝可促使胰腺通過非氧化途徑代謝乙醇,使得內臟NEFA和FAEE持續釋放,這可能由乙醇與脂質前體反應的有害成分介導[4]。

有報道稱,FAEE可通過誘導內質網第二信使受體鈣通道釋放引起胰腺腺泡細胞漿鈣超載,導致線粒體損傷和三磷酸腺苷生成減少,以及細胞內消化酶過早激活[13]。然而除了上述機制,FAEE還可能與AAP炎癥反應相關。AP是一種復雜的炎癥反應,異常激活胰蛋白酶,導致胰腺組織自我消化、水腫、出血,甚至壞死。在蛋白質觸發的炎癥級聯反應中,Toll樣受體(TLR),尤其是TLR4,通過一系列信號轉導整個激活的TLR4和核因子κB(NF-κB)途徑,最終促進細胞合成,分泌促炎細胞因子,如IL-1β和IL-6[14]。據報道,在注射乙醇和棕櫚油酸誘導的FAEE-AP小鼠模型中,發現血漿淀粉酶和包括促炎細胞因子在內的細胞因子水平特征性升高[15]。本研究中,AAP患者血漿FAEE與IL-1β及IL-6水平呈正相關。上述結果表明,血漿FAEE水平可能具有提示AAP患者炎癥反應程度的作用,進一步證明血漿FAEE水平作為AAP疾病嚴重程度診斷標志物的可行性。

但本研究有一定的局限性。首先,納入患者CT的檢查時間不統一,而AP的局部并發癥可能取決于CT檢查時間。其次,因為納入的大多數患者都是慢性飲酒者,很難在入院時獲得準確的飲酒史細節,因此本文沒有評估飲酒量與血漿FAEE水平的相關性。

綜上所述,本研究的結果表明,血漿FAEE可用于鑒別診斷AAP患者和非酒精性AP患者,且在AAP患者中,隨著疾病嚴重程度加重,血漿FAEE水平也逐漸升高,可用于預測重度AAP。因此,血漿FAEE有可能成為AAP鑒別診斷和預測疾病嚴重程度的潛在生物標志物。