胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3的表達水平與肺腺癌惡性生物學行為間的關系*

張月馨,周 聰,譚義炫,王 微

儋州市人民醫院:1.腫瘤內科;2.肝膽外科;3.超聲科,海南儋州 571700

非小細胞肺癌屬威脅人類生命健康的重大疾病,在世界范圍內發病率及病死率均呈上升趨勢,且85%的非小細胞肺癌病理分型為肺腺癌[1]。盡管近年來隨靶向及免疫治療藥物等在治療轉移性或局部晚期肺腺癌中顯示出較好療效,但僅15%～30%的晚期患者可獲得持續緩解和長期生存[2]。因此,探索肺腺癌發生發展的驅動因素,對提升肺腺癌治療效果具有重要意義。肺腺癌高度浸潤和破壞性生長的生物學行為的內部因素與基因表達差異關系密切,其中p16基因已被研究證實,其缺失及突變是肺腺癌發生的晚期事件[3],而具體的分子機制尚未得到廣泛研究。甲狀腺轉錄因子-1(TTF-1)是調控基因表達的一種轉錄因子,有研究表明,在肺腺癌中TTF-1染色強度與病灶分化程度及組織學類型關系密切[4];半乳糖凝集素-3(Galectin-3)參與生物體細胞黏附、遷移、上皮組織的修復等多種生理活動,是一種潛在的肺癌腫瘤標志物[5]。肺癌以胸腔積液為首發癥狀時,其病理類型不明確,可通過胸腔積液沉渣包埋及標記免疫蛋白確定腫瘤病理類型,能減少穿刺活檢帶來的痛苦,基于此,本研究旨在探討胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3表達在與肺腺癌惡性生物學行為中的關系,為臨床完善相關診療方案提供參考?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年10月至2023年3月在本院就診的肺腺癌患者163例,根據分化程度分為高分化組(26例)、中分化組(78例)、低分化組(59例)。其中高分化組男12例,女14例,年齡43～78歲,平均(59.87±6.45)歲;體重指數(BMI)18～27 kg/m2,平均(22.38±1.86)kg/m2;吸煙6例。中分化組男37例,女41例,年齡42～77歲,平均(59.31±5.86)歲;BMI 18～27 kg/m2,平均(22.57±1.29)kg/m2;吸煙15例。低分化組男28例,女31例,年齡42～79歲,平均(60.43±7.06)歲;BMI 18～28 kg/m2,平均(22.64±1.53)kg/m2;吸煙14例。3組性別、年齡、BMI、吸煙人數基線資料比較,差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準:(1)根據《中華醫學會腫瘤學分會肺癌臨床診療指南(2021版)》[6]診斷確診,且行手術切除,病理結果證實;(2)原發性肺腺癌;(3)年齡≥18歲;(4)TNM分期Ⅰ～Ⅲ期;(5)知情本研究內容,簽署同意書。排除標準:(1)合并其他腫瘤疾病;(2)入組前已接受放化療、免疫治療等;(3)腫瘤多發轉移;(4)預計生存期不足6個月或自愿放棄治療。本研究已通過本院倫理委員會審批(審批號:20200911026),所有入組患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3表達水平 患者入組后均在治療前采取胸腔穿刺術采集胸腔積液樣本100 mL,置肝素抗凝離心管內,3 000 r/min離心5 min,棄上清液,用軟吸管將細胞塊移至包埋紙,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅染色,光鏡觀察。M020蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒由上海歌凡生物科技有限公司提供。胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3蛋白陽性信號均為棕黃色顆粒。高倍鏡下隨機取5個視野(每個視野至少觀察細胞數200 個),根據陽性細胞所占比率及染色深淺判斷:(1)陽性細胞所占比率評分為不足30%計1分,30%～70%計2分,>70%計3分;(2)染色深淺評分為無染色計0分,淺黃色計1分,棕黃色計2分,棕褐色計3分。(1)、(2)兩項評分的乘積作為總分,進行定量分析。

1.2.2p16基因mRNA表達 另取胸腔積液樣本100 mL,置肝素抗凝離心管內,3 000 r/min離心5 min,棄上清液,加Trizol裂解液提取細胞總RNA,紫外線吸收法測RNA純度,SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄RNA,獲得cDNA,UltraSYBR Mixture試劑對p16基因擴增(條件:95 ℃ 10 s,72 ℃ 15 s,55 ℃ 10 s,40個循環),參照擴增反應曲線計算p16基因mRNA表達量。正向引物:5′-TAGCTATAGCTAGCTAGCT-3′;反向引物:5′-GCGTACA TCGTAGCTAGCT-3′。上海信裕生物科技有限公司提供mRNA提取試劑盒。上述實驗均由相同資深檢驗科技師參照試劑盒說明書步驟規范完成。

1.3觀察指標 (1)對比3組胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3及p16基因mRNA表達水平。(2)分析胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平的相關性。(3)分析胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平間的依存關系。(4)分析胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平間的劑量-效應關系。

2 結 果

2.13組胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3及p16基因mRNA表達水平的比較 163例肺腺癌患者胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1(4.31±1.41)分,Galectin-3(4.00±1.59)分,p16基因mRNA(1.59±0.50)。3組胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3及p16基因mRNA表達經單因素方差分析,差異有統計學意義(P<0.05),兩兩對比,低分化組胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3表達水平高于中分化組、高分化組,p16基因mRNA表達水平低于中分化組、高分化組,中分化組胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3表達水平高于高分化組,p16基因mRNA表達水平低于高分化組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3及p16基因mRNA表達水平的比較

2.2胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平的相關性分析 經Spearman秩相關系數分析胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1(r=-0.752,P<0.001)、Galectin-3(r=-0.811,P<0.001)與p16基因mRNA表達水平呈負相關。見圖1、2。

圖1 胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1與p16基因mRNA 表達水平相關性分析

圖2 胸腔積液沉渣包埋組織Galectin-3與p16基因 mRNA表達水平相關性分析

2.3肺腺癌患者p16基因mRNA表達的單因素分析 單因素分析結果顯示,性別、年齡、BMI、吸煙情況、表皮生長因子受體基因是否突變、家族史、病灶分布與肺腺癌患者p16基因mRNA表達水平無關(P>0.05)。血清癌胚抗原、血清細胞角蛋白19 片段、胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3表達水平均與肺腺癌患者p16基因mRNA表達有關(P<0.05)。見表2。

表2 肺腺癌患者p16基因mRNA表達水平的單因素分析

2.4分析胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平間的依存關系 將2.3中P<0.05項目作為自變量,將p16基因mRNA表達水平作為因變量,賦值見表3,首先進行多重共線性檢驗,TNM分期、淋巴結轉移與腫瘤最大徑、血清癌胚抗原、血清細胞角蛋白 19 片段、胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、胸腔積液沉渣包埋組織Galectin-3存在多重共線性(VIF>5),移除混雜因素,僅保留腫瘤最大徑、血清癌胚抗原、血清細胞角蛋白 19 片段水平、胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1表達水平、胸腔積液沉渣包埋組織Galectin-3表達水平納入多元線性回歸分析,結果顯示,胸腔積液沉渣包埋組織Galectin-3與p16基因mRNA表達水平間的線性依存關系無統計學意義(P>0.05),胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1與p16基因mRNA表達水平間有線性依存關系(P=0.049),但檢驗結果處于邊界水平,尚無法判斷胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平間的線性依存關系。見表4。

表3 賦值說明

表4 分析胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平間的依存關系

2.5分析胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平間的劑量-效應關系 限制性立方樣條圖分析顯示,胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平存在非線性劑量-效應關系(均P<0.05),胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平均大致呈“L”型,拐點處胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1表達水平大致為4分,胸腔積液沉渣包埋組織Galectin-3表達水平大致為3分,當胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1表達水平<4分、胸腔積液沉渣包埋組織Galectin-3表達水平<3分時,對p16基因mRNA表達水平作用最顯著。進一步控制腫瘤最大徑、血清癌胚抗原、細胞角蛋白 19 片段后胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平仍均大致呈“L”型。見圖3、4。

注:A為未調整混雜因素;B為調整腫瘤最大徑、血清癌胚抗原、細胞角蛋白19片段后。

注:A為未調整混雜因素;B為調整腫瘤最大徑、血清癌胚抗原、細胞角蛋白19片段后。

3 討 論

近年來,隨著人們對肺腺癌分子標記物研究的不斷深入,這些分子定向療法及以此為基礎的經驗性治療方案能在一定程度上提升肺腺癌患者的總生存期。但肺腺癌常有區域性淋巴結及血行轉移,其進展不可控,患者病死率仍然很高。因此,研究肺腺癌發生發展機制,繼續尋找高靈敏度及特異度分子標志物對指導臨床完善治療方案具有重大意義。

轉移是造成腫瘤患者病死的重要惡性生物學行為,轉移的每個階段均受基因及其表達產物的瞬時或持續調控,相關基因的激活或過度表達及失活或表達不足均是腫瘤細胞轉移的關鍵因素[7]。p16基因是細胞周期中的一種基本基因,主要通過抑制細胞周期素依賴性激酶4和細胞周期素依賴性激酶6活性而負調節細胞增殖及分裂,當p16基因異常時會使細胞停止于G1期,繼而影響細胞的增殖及分化[8]。近年來多項研究已證實,p16基因種系失活或表達不足與多種腫瘤相關,包括胰腺癌、肺腺癌等,p16基因是腫瘤惡性生物學行為的重要調控基因[9-10]。本研究檢測肺腺癌患者胸腔積液細胞發現,隨分化程度降低,p16基因mRNA表達呈降低趨勢,主要是因細胞分化發生于細胞分裂的G1期,當p16基因失活或表達不足時致使細胞異常增生,此時細胞分化減慢,結論與上述研究一致,但與調控肺腺癌p16基因表達相關的分子機制尚未明確。另外,胸腔積液細胞學是臨床診斷腫瘤的常用方法,與常規細胞學涂片對比,胸腔積液沉渣包埋組織能顯著增加細胞的觀察數量,且結構清晰,染色清楚,能顯著提高診斷準確性。TTF-1是生理狀態下主要分布在甲狀腺及部分大腦前腹側核,在肺組織中表達于Ⅱ型肺泡、終末細支氣管及肺Clara細胞。有研究表明,肺腺癌組織TTF-1陽性是肺腺癌出現表皮生長因子受體基因突變的獨立危險因素,其在肺腺癌診斷及鑒別診斷中具有重要意義[11]。本研究通過半定量法分析顯示,肺腺癌患者胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1表達隨細胞分化程度降低而升高。繼續分析發現,胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1表達與細胞p16基因mRNA表達呈負相關。分析機制可能是正常情況下TTF-1主要生理功能是維持終末呼吸單位細胞的功能穩定性,而TTF-1過表達則可能會過度激活細胞增殖相關基因,同時細胞增殖抑制基因活性減弱,p16基因作為負調節細胞增殖、分裂的基因,當TTF-1過表達時,p16基因活性可能隨之降低[12]。上述研究提示,胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1表達水平情況或可同樣用于肺腺癌惡性程度的評估。

Galectin-3是Galectin家族重要成員。研究已證實,Galectin-3表達陽性與宮頸癌、甲狀腺癌等多種腫瘤的惡性程度有關[13-14]。本研究對肺腺癌患者胸腔積液沉渣包埋組織進行檢測發現,細胞分化程度越高,Galectin-3表達越低,且Galectin-3表達與p16基因mRNA表達水平呈負相關。結合現有研究分析可能機制是:(1)Galectin-3的糖親和性能促進平滑肌細胞與內皮細胞的有絲分裂。楊柳等[15]研究顯示,下調Galectin-3有助于抑制肺癌H460細胞增殖。(2)Galectin-3具有抗凋亡活性。肖正紅等[16]研究表明,沉默Galectin-3可抑制卵巢癌細胞生長,誘導卵巢癌細胞凋亡。上述研究說明,Galectin-3表達水平可能與肺腺癌惡性生物學行為有關,但Galectin-3與p16基因mRNA表達水平間的直接關系尚未得到證實。本研究進行多元線性回歸分析發現,胸腔積液沉渣包埋組織Galectin-3與p16基因mRNA表達水平間的線性依存關系比較,差異無統計學意義(P>0.05),而胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1與p16基因mRNA表達水平間的線性依存關系處于邊界水平(P=0.049),進一步從限制性立方樣條圖得出,胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3與p16基因mRNA表達水平間存在非線性劑量-效應關系,二者均與p16基因mRNA表達水平大致呈“L”型,當胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1表達水平<4分、胸腔積液沉渣包埋組織Galectin-3表達水平<3分時,對p16基因mRNA表達水平作用最顯著。分析機制可能是生理情況下TTF-1、Galectin-3及p16基因mRNA正常表達,各自協同作用共同維持細胞正常的分裂、分化活動,早期病理改變TTF-1、Galectin-3對p16基因mRNA表達水平的調節作用較強,但隨病情進展,腫瘤細胞G1到S期的控制被破壞,增殖失控迫使抑制細胞增殖的p16基因mRNA表達水平降低[17-18]。但本研究的不足在于首次通過半定量法對肺腺癌患者胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3表達水平情況進行研究,所得界值在人群中的廣泛代表性仍需繼續探討。

綜上所述,胸腔積液沉渣包埋組織TTF-1、Galectin-3表達水平與肺腺癌惡性生物學行為關系密切,早期檢測對臨床實現精準干預避免病情惡化具有重要意義。