基于機器學習分析的浸潤性乳腺癌蛋白質編碼基因的標志物鑒定

武樂 閔開元 柳江楓 梁萬豐 楊曄宏 胡剛 楊俊濤

摘要：目的 應用隨機森林（RF）、極限梯度提升算法（XGBoost）、輕量的梯度提升機（LightGBM）、類別型特征提升（CatBoost）4種機器學習算法分析浸潤性乳腺癌轉錄組表達數據，篩選與浸潤性乳腺癌預后相關的生物標志物。方法 通過癌癥基因組圖譜公共數據庫下載浸潤性乳腺癌的表達數據，采用DESeq2程序包、t檢驗及Cox單因素分析，對人類浸潤性乳腺癌樣本中與生存預后相關的差異蛋白質編碼基因進行篩選?；赗F、XGBoost、LightGBM、CatBoost等機器學習模型的構建與比較，挖掘浸潤性乳腺癌預后相關的蛋白質編碼基因標志物，并使用基因表達綜合數據庫的乳腺癌表達數據作為外部測試進行驗證。結果 共獲得151個與生存預后相關的差異蛋白質編碼基因，其中由C3orf80、UGP2和SPC25 3個基因構建的機器學習模型效果較好。結論 篩選出3個（UGP2、C3orf80、SPC25）與浸潤性乳腺癌預后相關的生物標志物，為診斷和治療浸潤性乳腺癌提供了新的方向。

關鍵詞：浸潤性乳腺癌；生物標志物；蛋白質編碼基因；UGP2；C3orf80；SPC25

中圖分類號： R730.49文獻標識碼： A文章編號：1000-503X（2024）02-0147-07

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15717

Identification of Protein-Coding Gene Markers in Breast Invasive Carcinoma Based on Machine Learning

WU Yue¹，MIN Kaiyuan²，LIU Jiangfeng²，LIANG Wanfeng¹，YANG Yehong²，HU Gang¹，YANG Juntao²

¹School of Statistics and Data Science，Nankai University，Tianjin 300071，China

²State Key Laboratory of Common Mechanism Research for Major Diseases，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China

Corresponding authors：HU Gang Tel：022-23503423，E-mail：huggs@nankai.edu.cn；

YANG Juntao Tel：010-69156420，E-mail：yangjt@pumc.edu.cn

ABSTRACT：Objective To screen out the biomarkers linked to prognosis of breast invasive carcinoma based on the analysis of transcriptome data by random forest （RF），extreme gradient boosting （XGBoost），light gradient boosting machine （LightGBM），and categorical boosting （CatBoost）.Methods We obtained the expression data of breast invasive carcinoma from The Cancer Genome Atlas and employed DESeq2，t-test，and Cox univariate analysis to identify the differentially expressed protein-coding genes associated with survival prognosis in human breast invasive carcinoma samples.Furthermore，RF，XGBoost，LightGBM，and CatBoost models were established to mine the protein-coding gene markers related to the prognosis of breast invasive cancer and the model performance was compared.The expression data of breast cancer from the Gene Expression Omnibus was used for validation.Results A total of 151 differentially expressed protein-coding genes related to survival prognosis were screened out.The machine learning model established with C3orf80，UGP2，and SPC25 demonstrated the best performance.Conclusions Three protein-coding genes （UGP2，C3orf80，and SPC25） were screened out to identify breast invasive carcinoma.This study provides a new direction for the treatment and diagnosis of breast invasive carcinoma.

Key words：breast invasive carcinoma；biomarker；protein-coding genes；UGP2；C3orf80；SPC25

Acta Acad Med Sin，2024，46（2）：147-153

在全世界范圍內，癌癥是人類死亡和延長預期壽命的首要影響因素^［1］。Sung等^［2］研究顯示，在很多國家，癌癥是70歲前導致死亡的最重要原因。女性乳腺癌發病率已超過肺癌，成為最常被診斷的癌癥^［2］。浸潤性乳腺癌是乳腺癌的一種重要的組織學類型^［3］，且此類癌癥患者的預后較差。浸潤性乳腺癌是指上皮細胞異常增生且突破基底膜的一種惡性腫瘤，浸潤性小葉癌和浸潤性導管癌是兩種常見的浸潤性乳腺癌^［4］。一般可以通過癥狀體征、影像學檢查、病理學檢查、腫瘤標志物檢查、免疫組織化學檢查等方式對浸潤性乳腺癌進行評估，其中病理學檢查是浸潤性乳腺癌診斷的金標準。雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）等因子對浸潤性乳腺癌的發生發展有重要意義，比如浸潤性小葉癌通常具有較強的雌激素受體/孕激素受體陽性^［4］。盡管近年已有許多治療方式被應用于乳腺癌的治療^［5-6］，但缺乏有效標志物是有效治療的主要原因，也是預后不良的主要原因^［7］。新發現的生物標志物在浸潤性乳腺癌患者的治療中展示出了極好的價值。例如，檢測CD133和乙醛脫氫酶1在浸潤性導管乳腺癌中的表達有助于更準確地預測侵襲性，確定最佳治療方案^［8］。近年來，應用機器學習算法建立預測模型并鑒別癌癥中的生物標志物已成為趨勢^［9］，特別是基于樹算法的機器學習分類模型被廣泛應用。機器學習分類模型可以較為準確地分析預測高維度、復雜、信息互補的生物數據^［10］。盡管大多數的機器學習算法都很難解釋模型是如何工作的，但基于樹的機器學習算法具有規則提取和臨床可解釋性的優勢^［11-12］。極限梯度提升算法（extreme gradient boosting，XGBoost）、輕量的梯度提升機（light gradient boosting machine，LightGBM）和類別型特征提升（categorical boosting，Catboost）是基于梯度提升樹代表性的3個算法，隨機森林（random forest，RF）是一種基于套袋法的集成學習方法，它們在處理大規模數據時的訓練速度和準確率表現都很好。因此，本研究應用4種常用的基于樹的機器學習算法挖掘浸潤性乳腺癌蛋白質編碼基因表達數據，建立機器學習預測模型，篩選新的預后相關蛋白質編碼基因標志物，為浸潤性乳腺癌的臨床診斷和治療提供新的策略。

1 資料和方法

1.1 樣本信息及數據處理

2023年2月從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）公共數據庫獲得原始計數和每百萬條讀數的轉錄本兩種類型的浸潤性乳腺癌轉錄組測序數據作為訓練集及測試集（浸潤性乳腺癌組織樣本1101例，正常乳腺組織樣本113例）。2023年9月從基因表達綜合數據庫下載乳腺癌表達數據（GSE42568）作為外部測試集（乳腺癌組織樣本104例，正常乳腺組織樣本17例）；10月從基因表達綜合數據庫下載不同分子類型的乳腺癌表達數據（GSE80999）作為外部測試集（三陰性乳腺癌組織樣本36例，HER2過表達型乳腺癌組織樣本32例，腔面A型乳腺癌組織樣本121例，腔面B型乳腺癌組織樣本69例，正常乳腺組織樣本25例）。將從TCGA數據庫獲得的數據集以7∶3比例以分層采樣方式分為訓練集和測試集。每百萬條讀數的轉錄本類型數據經過log2轉換后，對訓練集和測試集分別進行異常值處理，即將極端異常值替換為上四分位數加上3倍的四分位距（Q3+3IQR）或下四分位數減去3倍的四分位距（Q1-3IQR），以及0～1歸一化處理。對訓練集數據進行采樣后，采用特征遞歸消除進行特征選擇，使用特征選擇后的特征構建機器學習模型，采用十折交叉驗證方式進行參數的調整與優化。使用測試集及外部測試集數據驗證模型。

1.2 機器學習分析

采用mlr3verse和mlr3extralearners包實現RF、XGBoost、LightGBM、CatBoost算法篩選與浸潤性乳腺癌預后相關的生物標志物。

1.3 統計學處理

使用R軟件（V4.2.0）的 DESeq2程序包和t檢驗分別對訓練集原始計數類型和每百萬條讀數的轉錄本類型數據進行差異分析。采用Cox單因素分析對預后相關基因進行分析。P<0.05或校正后P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生存預后相關的差異表達基因識別

從TCGA數據庫獲得浸潤性乳腺癌的原始計數和每百萬條讀數的轉錄本類型的轉錄組表達數據，并對兩種類型的訓練集數據分別進行差異表達分析，結果顯示對于原始計數類型，采用∣log差異倍數∣>1和校正后P<0.001的納入標準，共獲得2736個在浸潤性乳腺癌組織和正常乳腺組織之間差異表達的基因，其中表達水平上調基因1535個，表達水平下調基因1201個（圖1A）；對于每百萬條讀數的轉錄本類型，采用∣log差異倍數∣>0.5849和校正后P<0.05的納入標準，共獲得6703個在浸潤性乳腺癌組織和正常乳腺組織之間差異表達的基因，其中表達水平上調基因3825個，表達水平下調基因2878個（圖1B）；共獲得2594個相同上調和下調的差異表達基因（圖1C）。排除正常乳腺組織樣本，采用TCGA數據庫中每百萬條讀數的轉錄本類型的訓練集數據分析浸潤性乳腺癌基因高、低表達組與浸潤性乳腺癌患者預后之間的關聯，結果顯示Cox單因素分析篩選出736個高表達但生存率較差的基因（圖1D）。將此736個基因與上述獲得的2594個差異基因取交集，共獲得生存預后相關的差異表達基因151個進行下一步分析。

2.2 機器學習模型的構建

由于浸潤性乳腺癌組織樣本與正常乳腺組織樣本不平衡，對訓練集樣本（浸潤性乳腺癌組織樣本771例、正常乳腺組織樣本80例）進行過采樣得到平衡樣本后進行機器學習模型的構建。為了建立蛋白質編碼基因特征，使用訓練集過采樣樣本的數據對151個生存預后相關的差異基因采用遞歸特征消除方式進行特征選擇，進一步篩選得到9個基因（ABHD12、C3orf80、CKS2、KLF11、PCLAF、SPC25、TYRO3、UBE2T、UGP2），然后，基于上步得到的9個基因分別使用RF、XGBoost、LightGBM、CatBoost算法建立訓練模型，F1分數分析顯示，RF和LightGBM訓練模型的F1的十折平均分數（0.997）顯著高于XGBoost和CatBoost模型的F1的十折平均分數（0.996、0.994）。采用RF算法（決策樹數量為8個，葉節點上允許最小樣本數為18個）進一步訓練模型，根據解釋變量按重要性進行排序的結果顯示，使用前3個解釋變量（C3orf80、UGP2和SPC25）建立生存預后相關基因簽名時，訓練模型的效果更好。

2.3 機器學習模型的評價

將3個基因（C3orf80、UGP2和SPC25）作為特征使用RF模型進行訓練，結果顯示在訓練集和測試集中3個基因組合的受試者工作特征曲線下的面積（area under curve，AUC）結果最優（圖2A、2B），在訓練集中3個基因組合的AUC值為1.000，C3orf80和SPC25單個基因模型的AUC值均為1.000，UGP2單個基因模型的AUC值為0.999；在測試集中3個基因組合的AUC值為0.996，C3orf80、UGP2及SPC25單個基因的AUC值分別為0.865、0.851、0.978。在外部測試集中（GSE42568），3個基因組合的AUC值為0.850（圖2C）。此外，三陰性乳腺癌、HER2過表達型、腔面A型、腔面B型乳腺癌的主要分子分型在外部測試集中（GSE80999）的3個基因組合的AUC值分別為0.801、0.926、0.665、0.912（圖2C）。

2.4 蛋白質編碼基因分析

在浸潤性乳腺癌的全部數據集中，對C3orf80、UGP2和SPC25基因的表達進行分析。結果顯示C3orf80和SPC25基因在腫瘤組織中的表達高于正常乳腺組織，而UGP2基因在腫瘤組織中的表達低于正常乳腺組織（P均<0.001）（圖3A）?；谥鞒煞址治龊蜔釄D顯示，C3orf80、UGP2和SPC25蛋白質編碼基因可以區分浸潤性乳腺癌與正常組織（圖3B、3C）。采用Kaplan-Meier方法，探討C3orf80、UGP2和SPC25基因表達水平在浸潤性乳腺癌患者預后中的價值，結果顯示浸潤性乳腺癌患者的C3orf80（P=0.029）、UGP2（P=0.005）和SPC25（P=0.030）基因高、低表達的生存率差異均有統計學意義，高表達患者的總生存期預后較差（圖3D）。

3 討論

盡管近年乳腺癌患者的診斷和預后水平有所提高，但仍然是癌癥相關死亡的主要原因，到2020年，女性乳腺癌在全球約有226萬新發病例和68萬死亡病例^［2］。本研究將統計方法、機器學習算法與生物學原理相結合進行分析，旨在識別和驗證浸潤性乳腺癌預后相關的生物標志物，以提高浸潤性乳腺癌的診斷和生存率。本研究從TCGA數據庫獲得浸潤性乳腺癌的蛋白質編碼基因表達數據，將浸潤性乳腺癌樣本分為訓練集及測試集，使用訓練集數據比較浸潤性乳腺癌組織和正常乳腺組織基因表達的差異，對浸潤性乳腺癌組織樣本進行生存分析，得到151個預后相關的差異基因。使用訓練集數據進行特征選擇后，分別建立RF、XGBoost、LightGBM、CatBoost模型進行比較，選擇RF最優算法模型，并使用測試集數據對最優算法模型進行驗證，篩選出C3orf80、UGP2和SPC25蛋白質編碼基因。C3orf80、UGP2和SPC25可能是浸潤性乳腺癌患者新的生物標志物，為浸潤性乳腺癌的有效診斷和個體化治療提供依據。

研究顯示機器學習算法已經越來越多地被用于癌癥預測、篩選癌癥相關的生物標志物^［13-14］，更可以有效地預測乳腺癌的生物標志物^［15］，可以通過LASSO特征選擇機器學習和生物信息學分析鑒定三陰性乳腺癌關鍵預后基因^［16］，利用生物信息學和機器學習技術鑒定和探索乳腺癌熱分解相關分子亞型^［17］，但本研究采用的4種機器學習算法篩選新的生物標志物的研究較少。此外，UGP2是膽囊癌發展和預后不良的生物標志物，UGP2陽性表達與增殖標志物表達顯著相關^［18］，UGP2在人腦膠質瘤中異常過表達且與病理分級呈正相關，是人類膠質瘤細胞生長和運動進展標志物^［19］，急性髓系白血病的UGP2高表達與較差的生存率明顯相關^［20］；SPC25是組成核分裂循環80復合體的4個蛋白質之一，SPC25在乳腺癌組織中轉錄組表達上調，高表達水平與乳腺癌患者復發概率增加和生存率降低有關^［21］，SPC25在非小細胞肺腺癌中表達上調，獨立預測較差的生存率^［22］，SPC25過表達促進腫瘤增殖，是肝細胞癌生存率差的預后因素^［23］。然而，UGP2和C3orf80在乳腺癌的類型中相關報道較少。本研究為進一步探討浸潤性乳腺癌相關診斷與治療提供了新的指標。

綜上，本文使用機器學習方法從151個與預后相關的差異基因中鑒定出3個診斷生物標志物，即C3orf80、UGP2和SPC25基因，可能在浸潤性乳腺癌的進展中具有重要影響。此外，本研究顯示UGP2和C3orf80是診斷和治療浸潤性乳腺癌新的潛在預后相關的生物標志物。然而，這些基因在浸潤性乳腺癌發生發展過程中的分子機制尚需進一步闡明。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 胡剛、楊俊濤：對論文進行選題、設計并審閱修訂論文的關鍵問題；武樂：分析數據、起草并修改論文；閔開元：提供數據分析支持、撰寫論文；柳江楓：對蛋白質組數據提供分析支持并撰寫相關內容；梁萬豐：對數據進行生存分析并撰寫相關內容；楊曄宏：對外部測試數據集進行驗證分析并撰寫相關內容

參 考 文 獻

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（收稿日期：2023-06-09）