靈仙新苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織氧化應激和炎癥反應的調控及神經細胞凋亡的影響

熊建 屈戰利 任瑜 季一飛

本文引用： 熊? 建， 屈戰利， 任? 瑜， 季一飛. 靈仙新苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織氧化應激和炎癥反應的調控及神經細胞凋亡的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2024， 44（4）： 551-556.

〔摘要〕 目的 研究靈仙新苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織氧化應激反應、神經細胞凋亡以及炎癥因子的作用。方法 45只大鼠分成對照組、模型組（腦缺血再灌注損傷大鼠）、靈仙新苷低劑量組（8 mg/kg）、靈仙新苷中劑量組（16 mg/kg）、靈仙新苷高劑量組（32 mg/kg），每組9只。治療5 d后，對大鼠進行神經功能評分，TTC染色法檢測腦梗死體積，TUNEL法檢測細胞凋亡，Western blot檢測腦組織中切割型胱天蛋白酶-3（cleaved-cysteine aspartic acid specific protease-3，C-Caspase-3）、切割型胱天蛋白酶-9（cleaved-cysteine aspartic acid specific protease-9，C-Caspase-9）、核因子κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）蛋白水平，二硝基苯肼法檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，黃嘌呤氧化法檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）水平，ELISA法檢測白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。結果 與對照組比較，模型組大鼠神經功能評分升高（P<0.05），腦梗死體積增加（P<0.05），細胞凋亡指數和C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平升高（P<0.05），LDH、MDA水平升高（P<0.05），SOD、GSH-Px水平降低（P<0.05），IL-1β、TNF-α含量升高（P<0.05），NF-κB p65蛋白表達水平升高（P<0.05）。與模型組比較，靈仙新苷低、中、高劑量組大鼠神經功能評分依次降低（P<0.05），腦梗死體積依次減少（P<0.05），細胞凋亡指數和C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平依次降低（P<0.05），LDH、MDA水平依次降低（P<0.05），SOD、GSH-Px水平依次升高（P<0.05），IL-1β、TNF-α含量依次降低（P<0.05），NF-κB p65蛋白表達水平依次降低（P<0.05）。結論 靈仙新苷能降低腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織氧化應激反應水平，減少細胞凋亡因子C-Caspase-3、C-Caspase-9的表達，抑制炎癥介質釋放，其機制可能與下調NF-κB信號通路有關。

〔關鍵詞〕 靈仙新苷;腦缺血再灌注損傷;氧化應激;細胞凋亡;炎癥因子

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.004

Effects of Clematichinenoside AR on oxidative stress and inflammatory response regulation and nerve cell apoptosis in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury

XIONG Jian， QU Zhanli， REN Yu， JI Yifei*

Department of Neurology， Nanchong Central Hospital （The Second Clinical Medical College of North Sichuan?Medical College）， Nanchong， Sichuan 637000， China

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Clematichinenoside AR on oxidative stress response， nerve cell apoptosis， and inflammatory factors in the brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury. Methods Forty-five rats were divided into control group， model group （rats with cerebral ischemia reperfusion injury）， and Clematichinenoside AR low-（8 mg/kg）， medium-（16 mg/kg）， and high- （32 mg/kg） dose groups， with nine rats in each group. After 5 d of treatment， the rats were scored for neurological function. TTC staining was used to check cerebral infarction volume， TUNEL method to measure the degree of apoptosis， Western blot to determine the protein levels of cleaved-cysteine aspartic acid specific protease-3 （C-Caspase-3）， cleaved-cysteine aspartic acid specific protease-9 （C-Caspase-9）， and nuclear factor-κB p65 （NF-κB p65） in the brain tissue， dinitrophenylhydrazine method to examine the lactate dehydrogenase （LDH） level， thiobarbituric acid method to measure the malondialdehyde （MDA） level， xanthine oxidation method to check the superoxide dismutase （SOD） level， colorimetry to examine the glutathione peroxidase （GSH-Px） level， and ELISA to determine the content of interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α）. Results Compared with the control group， the neurological function score in the model group increased （P<0.05）， the cerebral infarction volume increased （P<0.05）， the apoptosis index and the protein levels of C-Caspase-3 and C-Caspase-9 increased （P<0.05）， the levels of LDH and MDA increased （P<0.05）， SOD and GSH-Px levels decreased （P<0.05）， the content of IL-1β and TNF-α increased （P<0.05）， and the protein expression level of NF-κB p65 increased （P<0.05）. Compared with the model group， the neurological function score in Clematichinenoside AR low-， medium-， and high-dose groups decreased successively （P<0.05）， the cerebral infarction volume decreased successively （P<0.05）， the apoptosis index and the protein levels of C-Caspase-3 and C-Caspase-9 decreased successively （P<0.05）， the levels of LDH and MDA decreased successively （P<0.05）， the levels of SOD and GSH-Px increased successively （P<0.05）， the content of IL-1β and TNF-α decreased successively （P<0.05）， and the protein expression level of NF-κB p65 decreased successively （P<0.05）. Conclusion Clematichinenoside AR can reduce the level of oxidative stress response in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury， decrease the expressions of apoptosis factors of C-Caspase-3 and C-Caspase-9， and inhibit the release of inflammatory mediators， which may be related to downregulation of the NF-κB signaling pathway.

〔Keywords〕 Clematichinenoside AR; cerebral ischemia reperfusion injury; oxidative stress; apoptosis; inflammatory factor

缺血性腦血管疾病有高致殘率、高復發率、高死亡率等特點，是一種極為常見的疑難性疾病，據統計，約有75%的腦血管疾病為腦梗死，發生在大腦中動脈者占據60%[1]。溶栓治療恢復血液流通是腦缺血疾病的治療方法，但治療過程往往伴隨腦缺血再灌注損傷的發生，其可誘導腦功能異常[2]。研究顯示，腦缺血再灌注損傷是一系列級聯反應，其中包括氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應等[3]。靈仙新苷是從威靈仙中提取的皂苷類物質，具有抗炎、調節血脂等功效[4]。有研究顯示，靈仙新苷對缺血再灌注損傷有治療作用，其可以減少心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中炎癥因子水平，減少細胞凋亡[5]。既往研究顯示，靈仙新苷對缺血性腦中風有治療作用[6]。目前尚未見關于靈仙新苷在腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激和炎癥因子表達中的作用研究。p65是核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路的關鍵組成部分，其在腦缺血再灌注損傷中過度激活，下調NF-κB，改善腦組織炎癥、氧化應激和細胞凋亡[7]。本實驗構建腦缺血再灌注損傷大鼠模型，探討靈仙新苷對大鼠腦組織炎癥、氧化應激、細胞凋亡和NF-κB p65蛋白表達的影響，為靈仙新苷治療腦缺血再灌注損傷提供理論數據。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 動物? 45只SPF級大鼠，雄性，體質量280～300 g，3～4月齡，購自成都達碩實驗動物有限公司。大鼠飼養于川北醫學院實驗動物中心，溫度（26±2） ℃，濕度55%±10%，12 h光暗循環，許可證號為SYXK（川）2023-0076。本實驗方案經本院動物倫理委員會審批（審批號：202302006）。

1.1.2? 主要試劑? 靈仙新苷（純度98.5%，成都普思生物科技有限公司，批號：PU0009-0010）;NF-κB p65抗體（美國Abcam公司，批號：ab16502）;乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，批號：E1020）;切割型胱天蛋白酶-9（cleaved-cysteine aspartic acid specific protease-9，C-Caspase-9）抗體（美國GeneTex公司，批號：GTX132331）;切割型胱天蛋白酶-3（cleaved-cysteine aspartic acid specific protease-3，C-Caspase-3）抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：9661）;谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術公司，批號：S0056）;白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：ml003057、ml002859）;丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：BC0025）;超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（上海尚寶生物科技有限公司，批號：BA1696）;TUENL細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號：556547）。

1.1.3? 主要儀器? DR-200BS型全自動多功能酶標分析儀[南北科儀（北京）科技有限公司];RX50型熒光顯微鏡（上海普丹光學儀器有限公司）;NanoDrop One/OneC型超微量核酸蛋白濃度測定儀、iBrightTM CL1500型成像系統、Sorvall LYNX 4000型高速離心機（美國Thermo Scientific公司）。

1.2? 腦缺血再灌注損傷大鼠模型構建

以改良Zea-Longa線栓法[8]構建腦缺血再灌注損傷大鼠模型。構建模型前8 h禁食，不限制飲水，按照50 mg/kg的劑量用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定，消毒。在頸部正中位置切口，將左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈暴露，然后在頸內和頸外動脈的分叉位置將頸外動脈結扎，在左側頸總動脈處剪開一個小口，將直徑0.26 mm的尼龍魚線插入，再用尼龍魚線將頸總動脈結扎。縫合皮膚，將線頭留在體外。手術后2 h，進行再灌注操作，再灌注只抽提拴線到達頸總動脈。大鼠清醒后，對大鼠進行神經功能評分，1～3分表示造模成功[9]。

1.3? 分組與給藥

剔除造模失敗的大鼠，將造模成功的36只大鼠隨機分為靈仙新苷低、中、高劑量組和模型組，每組9只。另取9只大鼠只分離動脈，不插入尼龍魚線，設為對照組。靈仙新苷低、中、高劑量組大鼠在再灌注12 h以后，按照1次/d繼續灌胃8、16、32 mg/kg靈仙新苷[6]，持續灌胃5 d;對照組和模型組使用等體積生理鹽水灌胃。在最后一次灌胃結束后30 min，對大鼠進行神經功能評分，然后用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取腦組織，用于后續檢測。

1.4? 神經功能評分

按照Longa評分標準[9]對大鼠進行神經功能評分。大鼠表現為無神經功能缺損記為0分;大鼠右側前爪不能完全伸展記為1分;大鼠在爬行時出現向右側轉圈的現象記為2分;大鼠在爬行時出現向右側傾倒的現象記為3分;大鼠無法行走，喪失意識記為4分。

1.5? 腦梗死體積檢測

沿前腦從額極至枕極的方向將腦組織切成冠狀切片，然后將切片放于2%的TTC溶液內，37 ℃避光反應30 min，至梗死區域呈現白色。利用Image J軟件分析腦梗死的體積。

1.6? LDH、MDA、SOD、GSH-Px水平檢測

取腦組織，制作組織勻漿液，然后分別利用試劑盒檢測LDH（二硝基苯肼法）、MDA（硫代巴比妥酸法）、SOD（黃嘌呤氧化法）、GSH-Px（比色法）水平，步驟按照試劑盒標準流程操作。

1.7? IL-1β、TNF-α含量檢測

取腦組織，制作組織勻漿液，使用ELISA法分別檢測IL-1β、TNF-α含量，步驟按照試劑盒說明書進行。

1.8? 細胞凋亡檢測

取腦組織，用4%多聚甲醛固定，用PBS洗滌3次，然后放在流水中將組織洗滌過夜，用PBS再次洗滌3次，放在20%、25%、30%的蔗糖溶液中沉底，冰凍切片，切片的厚度約為5 μm。用蛋白酶K通透細胞，4%多聚甲醛固定，滴加TUNEL染液，37 ℃孵育1 h，用過氧化氫封閉，DAB顯色。在顯微鏡下觀察陽性細胞數，隨機選擇5個視野，計算細胞凋亡指數。

1.9? C-Caspase-3、C-Caspase-9、NF-κB p65蛋白表達檢測

取腦組織，剪碎后，在組織中添加RIPA裂解液，放于冰上充分裂解20 min，轉移至離心機中，以4 ℃、10 000×g離心10 min，吸取上清液，按照BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。將上樣緩沖液添加到蛋白樣品中充分混合，置于100 ℃條件下煮沸5 min。利用常規方法分別制備10%的分離膠和5%的濃縮膠，在每個孔中分別添加蛋白樣品量40 μg。打開電源，首先設置初始電壓為60 V，觀察到染料移動至分離膠時，將電壓調整為100 V，染料進入玻璃板底部位置后，停止電泳，將電源關閉。取出凝膠，裁剪NC膜，浸泡在轉移緩沖液中。4 ℃轉膜，轉膜電流設置為200 mA。再繼續將NC膜置于5%脫脂奶粉內，37 ℃繼續反應1 h。取出NC膜，置于一抗稀釋液內（C-Caspase-3、C-Caspase-9、NF-κB p65抗體按照1∶600、1∶600、1∶800比例稀釋），然后置于4 ℃條件下反應過夜。將孵育過夜后的NC膜置于二抗稀釋液內（按1∶4 000比例稀釋），繼續在37 ℃條件下結合1 h。用ECL試劑顯影，采用Quantity one

4.6.2軟件分析各條帶的灰度值，以GAPDH為內參，分析蛋白的相對表達量。

1.10? 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件分析實驗數據，數據以“x±s”表示，兩組間比較采用t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 靈仙新苷對大鼠神經功能評分和腦梗死體積的影響

模型組大鼠神經功能評分及腦梗死體積比例明顯高于對照組（P<0.05）;與模型組比較，靈仙新苷低、中、高劑量組大鼠神經功能評分和腦梗死體積比例均降低（P<0.05）;靈仙新苷各劑量組神經功能評分和腦梗死體積比例均降低呈劑量依賴性（P<0.05）。詳見圖1、表1。

2.2? 靈仙新苷對大鼠腦組織中LDH、MDA、SOD、GSH-Px的影響

與對照組比較，模型組大鼠腦組織中LDH、MDA水平升高（P<0.05），SOD、GSH-Px水平降低（P<0.05）;與模型組比較，靈仙新苷低、中、高劑量組大鼠腦組織中LDH、MDA水平降低（P<0.05），SOD、GSH-Px水平升高（P<0.05）;靈仙新苷各劑量組腦組織中LDH、MDA水平降低，SOD、GSH-Px水平升高呈劑量依賴性（P<0.05）。詳見表2。

2.3? 靈仙新苷對大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α含量升高（P<0.05）;與模型組比較，靈仙新苷低、中、高劑量組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α含量降低（P<0.05）;靈仙新苷各劑量組腦組織中IL-1β、TNF-α含量降低呈劑量依賴性（P<0.05）。詳見表3。

2.4? 靈仙新苷對大鼠腦組織中神經細胞凋亡的影響

與對照組比較，模型組大鼠腦組織中神經細胞凋亡指數和C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達水平均升高（P<0.05）;與模型組比較，靈仙新苷低、中、高劑量組大鼠腦組織中神經細胞凋亡指數和C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達水平均降低（P<0.05）;靈仙新苷各劑量組腦組織中神經細胞凋亡指數和C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達水平均降低呈劑量依賴性（P<0.05）。詳見圖2、表4。

2.5? 靈仙新苷對大鼠腦組織中NF-κB p65蛋白表達水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠腦組織中NF-κB p65蛋白水平升高（P<0.05）;與模型組比較，靈仙新苷低、中、高劑量組大鼠腦組織中NF-κB p65蛋白表達水平降低（P<0.05）;靈仙新苷各劑量組腦組織中NF-κB p65蛋白表達水平降低呈劑量依賴性（P<0.05）。詳見圖3、表5。

3 討論

靈仙新苷是從威靈仙中提取的單體成分，有很多生物學活性，如抗炎、鎮痛等，靈仙新苷對動脈粥樣硬化小鼠血脂有調節作用，還能改善淋巴細胞功能[4]。以往研究發現，靈仙新苷對缺血再灌注損傷有治療作用，靈仙新苷治療后的心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中細胞凋亡減少，心肌損傷程度減輕[5]。在缺血誘導的腦中風動物模型中，靈仙新苷具有改善大鼠神經功能的作用[6]。本實驗結果顯示，靈仙新苷治療后，腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能明顯改善，腦梗死體積比例減少，說明靈仙新苷對腦缺血再灌注損傷有保護功能。

以往研究發現，缺血再灌注損傷發生機制復雜，涉及很多病理過程，例如氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等[10]。機體正常組織受到缺血再灌注刺激后，組織內會積累大量的氧自由基，而這些氧自由基的積累與抗氧化酶如SOD、GSH-Px等的活性降低有關[11]。組織中高水平的氧自由基可以誘導細胞內的脂質發生過氧化反應，最終生成MDA[12]。脂質是細胞膜的關鍵組成部分，因此，大量的氧自由基可以破壞細胞膜完整結構，促進LDH釋放[13]。氧自由基除可以誘導氧化損傷外，還能激活Caspase級聯反應。Caspase是一個含有多個蛋白成員的蛋白家族，在細胞凋亡激活中有極為重要的作用。Caspase-3和Caspase-9分別是Caspase級聯反應的下游及上游因子，二者活化以后可以誘導細胞凋亡發生[14]。炎癥介質對細胞凋亡有促進作用，其可以通過與氧自由基相互作用，進而調控細胞凋亡途徑[10]。IL-1β、TNF-α是存在組織內的炎癥介質，可激活炎癥反應，促進組織損傷[15]。本研究結果表明，靈仙新苷處理后，腦缺血再灌注損傷大鼠模型腦組織中細胞凋亡水平降低，細胞中SOD、GSH-Px活性升高，LDH和MDA水平降低，IL-1β、TNF-α含量減少，提示靈仙新苷能改善腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激、炎癥因子釋放和細胞過度凋亡。

腦缺血再灌注損傷發生機制復雜，受到多種信號通路的調控作用[16-17]。研究發現，NF-κB是一個與炎癥密切相關的中心樞紐，其激活可誘導下游多個炎癥因子的表達[18-19]。后續又在氧化損傷、細胞凋亡、細胞衰老等生理過程中發現了NF-κB的調控功能[20]。在腦缺血再灌注損傷中發現NF-κB過度激活可誘導組織損傷[21]。NF-κB信號通路由多個成員組成，p65為其關鍵激活因子，p65表達水平升高后NF-κB信號激活水平也升高[22]。本研究結果顯示，NF-κB p65在腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中表達水平升高，與LONG等[23]的研究結果一致，而靈仙新苷則可降低NF-κB p65蛋白的表達水平，提示靈仙新苷可能抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織NF-κB信號激活。

綜上所述，靈仙新苷對腦缺血再灌注損傷有改善作用，能抑制腦組織氧化損傷、細胞凋亡和炎癥因子釋放，降低NF-κB信號通路活化水平。本研究為靈仙新苷治療腦缺血再灌注損傷提供了數據支持，為研究靈仙新苷在腦缺血再灌注損傷中的作用機制提供了基礎。

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〔基金項目〕四川省自然科學基金項目（2022NSFSC0756）。

〔通信作者〕*季一飛，男，博士，主任醫師，E-mail：jiyifei-2003@163.com。