痛風石組織中巨噬細胞BCAS3和RFX3蛋白表達及意義*

董淑慧,徐 瑾

(天津市天津醫院病理科,天津 300211)

痛風是一組由于長期嘌呤代謝紊亂導致的以單鈉尿酸鹽晶體沉積為特征的疾病,以痛風性關節炎最為常見,其特征是血尿酸升高導致尿酸鹽晶體沉積在關節腔、軟骨、滑膜及周圍組織,引起局部關節突發疼痛、紅腫,反復發作可引起關節僵硬、變形,嚴重影響生活質量。痛風還可誘發痛風石、痛風性眼病、痛風性心臟病。臨床資料顯示,痛風還與腦血管疾病、代謝綜合征、糖尿病、腎臟疾病等有著密不可分的聯系,與其他合并癥一起,可以使患者的預期壽命總體下降[1-3]。近年來,由于我國經濟水平的提高和人們飲食結構的改變,痛風的發病率明顯升高,患病率為0.03%～10.47%[4];高尿酸血癥的發病還有明顯年輕化的趨勢[5]。目前高尿酸血癥和痛風在我國已成為一種常見的代謝性疾病。

目前認為遺傳、炎癥及免疫因素參與了痛風的發病[6],遺傳因素是主要因素。我國漢族人群的首個大樣本量全基因組關聯分析(GWAS)顯示,人類乳腺癌擴增序列3(BCAS3)和調節因子X3(RFX3)是我國人群特有的痛風易感基因[7]。單核巨噬細胞是參與痛風發病的主要炎癥細胞[8],是痛風石中數量最多的細胞。因此,本研究選擇手術切除的痛風石標本,應用免疫組織化學方法檢測痛風石中巨噬細胞的BCAS3和RFX3蛋白表達情況,分析兩種蛋白參與痛風的發病機制和對于痛風的診斷價值,以期為臨床預防、診斷和治療痛風篩選靶向藥物提供相關依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年4月至2022年12月本院痛風石切除標本30例為試驗組,均為男性,年齡(45.73±17.63)歲,血尿酸(577.04±145.89)μmol/L。同期切除的關節置換術后滑膜增生伴有異物巨細胞反應的標本25例、脂肪壞死伴有巨噬細胞增生的標本5例作為對照組,其中男16例,年齡(57.44±17.60)歲,血尿酸(343.92±104.93)μmol/L,女14例,年齡(60.86±15.41)歲,血尿酸(273.15±75.68)μmol/L。納入標準:(1)依據2013年中華醫學會內分泌學分會《高尿酸血癥和痛風治療的專家共識》標準[9],試驗組患者空腹血尿酸均>420 μmol/L;(2)痛風石標本均經組織印片偏光顯微鏡檢確認尿酸鹽晶體的存在,見圖1。排除標準:(1)具有類似表現的假痛風、類風濕關節炎等;(2)對照組患高尿酸血癥(男性空腹血尿酸>420 μmol/L,女性>360 μmol/L)、高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等。

圖1 偏光顯微鏡下尿酸鹽晶體(100×)

1.2 方法

1.2.1儀器與試劑

LEICA全自動免疫組織化學染色機,BCAS3單克隆抗體(克隆號DF9291)、RFX3多克隆抗體(克隆號ZC-4066)濃縮液購自上海茁葉生物科技有限公司;CD68、CD163抗體工作液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2免疫組織化學染色

將標本行3 μm掛膠切片,60 ℃烤箱烘烤2 h,在LEICA全自動免疫組織化學染色機上進行染色,常規脫水、透明、封片后鏡檢。CD68、CD163抗體為工作液;濃縮液按照使用說明書適度稀釋,BCAS3抗體稀釋濃度為1∶100,RFX3抗體稀釋濃度為1∶150。人腎臟組織和腦組織作為陽性對照,同時采用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3評分判斷標準

CD68、CD163定位于巨噬細胞的細胞質,對二者定位的細胞進行BCAS3和RFX3的染色結果判讀,陽性的標準定為棕褐色、棕黃色與黃色顆粒狀著色。根據巨噬細胞的染色強度和陽性細胞所占比例進行評分。顏色越深則分數越高,棕褐色、棕黃色、黃色分別記為3、2、1分,沒有著色記0分;在巨噬細胞密集區隨機觀察5個高倍視野(400×),在每個視野中計數100個巨噬細胞,一共計數500個巨噬細胞,陽性細胞所占比例≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%和>75%分別記為0、1、2、3和4分。兩種評分結果相加為最終得分。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各個抗體的細胞定位情況

CD68、CD163均定位于巨噬細胞的細胞質,多核巨噬細胞多表達CD68(圖2),單核巨噬細胞多表達CD163(圖3),二者相互補充標示出組織中的巨噬細胞。BCAS3定位于巨噬細胞的細胞核和細胞質(圖4),而RFX3主要定位于細胞質(圖5)。

圖3 痛風石中巨噬細胞表達CD163(200×)

圖4 痛風石中巨噬細胞表達BCAS3(200×)

圖5 痛風石中巨噬細胞表達RFX3(200×)

2.2 BCAS3、RFX3蛋白表達情況及相關性分析

試驗組BCAS3、RFX3蛋白表達明顯高于對照組(t=3.036、8.617,P=0.004、0.001),對照組不同性別BCAS3、RFX3蛋白表達比較差異無統計學意義(t=0.158、0.882,P=0.876、0.386),見表1。

表1 兩組BCAS3、RFX3蛋白表達比較

試驗組BCAS3蛋白表達與RFX3蛋白表達呈正相關(r=0.539,P=0.002)。試驗組血尿酸與BCAS3、RFX3蛋白表達均呈正相關(P<0.05),對照組血尿酸與BCAS3、RFX3蛋白表達不相關(P>0.05)。兩組年齡與BCAS3、RFX3蛋白表達不相關(P>0.05),見表2。

表2 血尿酸、年齡與BCAS3和RFX3的相關性分析

2.3 BCAS3、RFX3對痛風的診斷效能

RFX3的曲線下面積(AUC)、靈敏度、特異度分別為0.935、96.55%、86.67%,均高于BCAS3的0.742、70.00%和80.00%,說明RFX3對于痛風有更高的診斷價值,見表3、圖6。

表3 BCAS3和RFX3對痛風的診斷效能

圖6 ROC曲線分析

3 討 論

BCAS3位于染色體17q23,全長600 kb,含有24個外顯子,能夠編碼913個氨基酸,是一種細胞骨架蛋白,最早在乳腺癌組織中被發現過表達[10]。隨著研究的深入,BCAS3被認為和多種疾病相關,如腦腫瘤、腎臟疾病和原發性開角型青光眼等。LI等[11]發現,BCAS3的3個單核苷酸基因位點(rs9895661、rs9905274和rs11653176)的多態性與我國漢族男性人群的痛風相關聯。趙會文[12]研究發現,BCAS3單核苷酸基因多態性可能與我國沿海地區漢族男性人群的痛風易感性相關。痛風急性期和緩解期患者的外周血單個核細胞中BCAS3 mRNA表達均較健康人群明顯升高(P<0.05),推測rs9905274和rs11653176兩個位點的單核苷酸多態性可能會影響BCAS3的表達從而調節單核細胞的功能,進而促進白細胞介素(IL)-1β等炎性因子的釋放,導致痛風的發生。

本研究發現,試驗組BCAS3蛋白表達明顯高于對照組,說明BCAS3蛋白表達上調能夠調節巨噬細胞的功能來參與痛風的發病。JOSHI等[13]研究發現,BCAS3 作為一種細胞骨架蛋白,通過偶聯微管、中間絲,能夠促進血管發育過程中內皮細胞的遷移。據此,推測BCAS3也可能通過調節巨噬細胞的遷移能力來參與痛風的發病。作為一種炎癥性疾病,痛風的發病過程涉及巨噬細胞的極化和焦亡現象。在痛風的急性期巨噬細胞傾向于向M1型極化,釋放促炎因子,導致劇烈的炎癥反應;而在痛風的緩解期,巨噬細胞傾向于向M2型極化,抑制炎癥的發展和促進炎癥的消退,這可部分解釋痛風發作的“自限性”[14]。細胞焦亡是一種細胞程序性死亡方式,通過細胞腫脹并破壞細胞膜的完整性,造成細胞穿孔,細胞內代謝產物和炎性因子釋放,產生并擴大炎癥反應,是一種促炎程序性死亡。研究表明,抑制巨噬細胞焦亡可以減少活化的IL-1β釋放,從而緩解痛風的炎性反應[15]。巨噬細胞的極化和焦亡過程均涉及很多細胞因子和傳導通路,細胞骨架蛋白也必不可少地參與其中。作為一種細胞骨架蛋白的BCAS3是否在痛風發生的不同階段通過調節巨噬細胞的極化和焦亡來參與痛風的發病還有待進一步的研究。

RFX3是纖毛形成和功能調節的關鍵性轉錄因子之一。纖毛是存在于大多數脊椎動物細胞表面的保守細胞器,能夠感知對于細胞增殖、分化、極性調節和組織動態平衡至關重要的各種細胞外信號[16-17]。本研究發現,試驗組RFX3蛋白表達高于對照組(P<0.05),說明巨噬細胞通過高表達RFX3參與痛風的發病。巨噬細胞在免疫系統中發揮著重要作用,包括感知和吞噬異物、提呈抗原、釋放促炎因子、招募炎癥細胞等[18]。這些功能的實現很大程度上依賴于對肌動蛋白的調控[19]。肌動蛋白細胞骨架是一個高度平衡的動態網絡系統,參與如細胞遷移和膜運輸等重要的生物學過程,其基本功能是通過聚合作用來改變脂膜的結構[20]。其中重要的一員是生長的肌動蛋白細絲(F-actin),其有助于維持細胞形狀,建立和維持與細胞運動相關的膜突起,促進囊泡的運輸[21]。這些復雜的細胞功能的實現需要對F-actin的產生、穩定和周轉進行精密的時間和空間調節。有研究表明,分枝的F-actin對纖毛的形成有抑制作用[22]。

李脈超[23]發現巨噬細胞特異性RFX3基因敲除小鼠的巨噬細胞黏著斑增大,足小體增多,F-actin熒光強度增加,遷移能力增強,提示RFX3基因可能是通過促進F-actin 的產生從而抑制纖毛形成,改變巨噬細胞的遷移能力。同時,尿酸鹽介導的腹膜炎模型中條件性敲除RFX3小鼠腹腔灌洗液中IL-1β水平較對照組有明顯下降,表明敲除RFX3基因后,炎癥情況有所改善,RFX3在痛風的發病過程中具有促炎的作用[23]。這一研究部分解釋了RFX3參與痛風的發病機制。

本研究發現,試驗組BCAS3蛋白表達與RFX3蛋白表達呈正相關(r=0.539,P=0.002),說明二者在痛風的發病過程中可能具有一定的協同作用。雖然是比較弱的正相關,但二者都具有明確的促炎作用,均促進了痛風的發病。二者具體的相互關系和作用機制,需待相關通路研究清晰后確定。同時,試驗組血尿酸與BCAS3、RFX3蛋白表達均呈正相關(P<0.05),且RFX3的相關系數更高。由此推測,從遺傳因素方面,對于高尿酸血癥和痛風的發生,RFX3可能起到比BCAS3更為重要的作用。

ROC曲線分析顯示,RFX3對于痛風具有較高的診斷價值(AUC、靈敏度和特異度分別為0.935、96.55%和86.67%),說明巨噬細胞中RFX3在痛風發生過程中所起的作用較BCAS3更明顯。對于缺乏臨床癥狀而組織中發現可疑結晶沉積的患者,BCAS3和RFX3在巨噬細胞中的高表達(>5.30和>1.80)提示痛風的可能,為臨床診斷不典型痛風提供了新的途徑。

綜上所述,痛風石中巨噬細胞通過高表達BCAS3和RFX3參與痛風的發生。BCAS3可能是通過促進IL-1β等炎性因子的表達和釋放等方面參與痛風的發生,而RFX3可能是通過改變巨噬細胞的遷移能力并通過促炎作用參與痛風的發病,在痛風的發生過程中二者可能具有一定的協同促進作用。RFX3可能起到比BCAS3更為重要的作用,并且二者在巨噬細胞中的高表達對于痛風具有較高的診斷價值,為臨床診斷不典型的痛風和開發治療痛風的靶向藥物提供了理論依據。其中涉及的具體通路和相關蛋白還需要進一步的研究證實。