基于蛋白質組學探析針灸治療哮喘的作用機制

方 芳,劉新穎,顧媛媛,蒙艷麗,郭玉巖△,左 軍,龍 宇,郭媛琦

1.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省中醫藥科學院,黑龍江 哈爾濱 150036

哮喘為一種常見的呼吸系統疾病,根據全球哮喘倡議(GINA)報告,許多國家的患病率有所增加,特別是在兒童中[1],哮喘以咳嗽、喘息、呼吸短促和胸悶為典型臨床表現,并伴有呼氣氣流受限的癥狀[2],其發病嚴重影響人們的日常工作、學習和生活。吸入糖皮質激素(ICS)和支氣管擴張劑是哮喘治療的首選一線治療方法,可以控制哮喘癥狀、提高患者生活質量和改善肺功能,降低發病率和死亡率[3]。而長期使用ICS有明顯的副作用,據統計,在服用ICS的患者中,約有5%～10%的患者仍有呼吸困難的癥狀,并面臨嚴重哮喘惡化的風險[4-5]。除了一線療法外,一些補充和替代療法被證明具有明顯的優勢,針灸是臨床上治療哮喘的常用方法。然而,針灸治療哮喘的調控機制尚未完全闡明,本研究旨在基于蛋白質組學探析針灸治療哮喘的作用機制,為哮喘的治療提供新的思路和方法。

1 哮喘的發病機制研究

哮喘的發病機制復雜,目前尚無統一認識,普遍認為哮喘發病機制與氣道慢性炎性癥狀、氣道高反應性、氣道重塑、遺傳機制及機體免疫平衡遭到破壞有關,可由一種或多種因素共同作用。從氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑3方面討論哮喘的發病機制如下。

1.1 氣道炎癥

氣道炎癥是哮喘發病的核心環節,哮喘的炎癥反應是由多種炎癥細胞、炎癥介質和細胞因子參與并相互作用的結果,鈣結合在哮喘早期炎癥發生的過程中起核心作用[6],抗原通過抗原遞呈細胞激活T細胞,活化的輔助性T細胞(主要是Th2細胞)產生白細胞介素(IL)-4、IL-5及IL-13等進一步激活B淋巴細胞,后者合成特異性免疫球蛋白E(IgE),并結合肥大細胞和嗜堿性粒細胞(EOS)等細胞表面的IgE受體。由EOS、中心粒細胞、肥大細胞和T淋巴細胞等共同參與[2]。炎癥細胞合成和釋放多種炎性介質及細胞因子,造成氣道炎癥,導致哮喘發作。

1.2 氣道高反應性

氣道高反應性(AHR)是因氣道炎癥而貫穿哮喘全過程的氣道病理狀態。AHR反映由于一系列直接或間接刺激引起的氣道平滑肌(ASM)收縮增加或功能障礙。有研究表明,T細胞的生理活動是哮喘AHR和炎癥預后的關鍵因素[7]。T淋巴細胞亞群的變化中,以Th1/Th2和Th17/Treg平衡最為重要,Th2型細胞因子IL-13是哮喘發病的關鍵因子,通過促進黏液分泌和加重氣道高反應性而引發哮喘,而Th1的細胞因子IL-12能下調Th2型細胞因子,降低氣道高反應性,通過增強Th1細胞抑制Th2細胞分化促進Th1/Th2平衡的恢復[3],有助于哮喘的防治,Treg/Th17失衡也可能導致哮喘患者氣道高反應性,針刺可以緩解這種失衡,CD4+T細胞亞群的平衡參與了針灸治療哮喘氣道高反應性的治療過程[8]。

1.3 氣道重塑

氣道重塑是哮喘的主要病理特征,氣道重塑包括呼吸道的各種結構變化如上皮變化、粘液腺增生、上皮下膠原層增厚、粘膜下基質沉積增加、ASM肥大和增生以及ASM束中肥大細胞[2]。氣道重塑的最顯著特征之一是氣道平滑肌增厚,且無論是成年人還是兒童,平滑肌質量的變化都與哮喘的嚴重程度有關[4]。Rho/ rhokinase介導的信號通路在哮喘氣道平滑肌收縮、氣道重塑和氣道炎癥過程中起重要作用。TGF-β1被認為是氣道重塑的主要中介[9],整個哮喘病程中均有TGF-β1的分泌,且易導致皮層纖維化,哮喘急性發作期能促使氣道平滑肌細胞向上皮層移動,形成新的平滑肌束。Smads蛋白是TGF-β家族的特異性細胞內信號轉導分子,TGF-β1/Smads信號傳導通路可能通過調控平滑肌肌動蛋白(α-SMA)誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞,導致哮喘氣道重塑。劉慧慧等[10]發現針刺“肺俞”“定喘”“孔最”“魚際”均可下調哮喘大鼠高表達的TGF-β1、Smad3 mRNA蛋白水平,減輕氣道重塑。既往研究表明,平滑肌細胞可促進哮喘纖維增殖性氣道重塑,TGF-β1是關鍵誘導信號,TGF-β在哮喘氣道重塑的結構改變中起著重要作用[8]。

2 針灸治療哮喘

2.1 針灸治療哮喘的特點

針灸是中醫的組成部分,用于治療包括哮喘在內的多種疾病。現代醫學研究發現針灸療法主要通過對神經-免疫-內分泌網絡的調節發揮治療作用,針灸作為一種非特異性的物理刺激,對疾病的影響是通過激發體內固有的調節系統而實現的,通過人體經絡系統發揮整體調節和雙向調節等特點。

2.2 針灸治療哮喘的優勢

以針刺、灸法等療法為代表的針灸療法,是在中醫整體觀念以及辨證論治的指導下,通過調整人體臟腑氣血陰陽,達到改善肺功能、緩解臨床癥狀的功效。針灸療法被廣泛應用于哮喘等異質復雜疾病的治療,對比西醫西藥具有價格低廉的優勢。同時,針灸具有療效良好、安全性高和無副作用等優勢。近年來相關臨床研究逐漸增多,證實了針灸療法具有改善肺功能、調節人體免疫、改善哮喘癥狀以及提高活動耐量的作用,受到越來越多患者的接受和認可,大量臨床報道證明針灸治療哮喘有效。徐寧等[11]選取邵經明教授總結的治療哮喘的經驗穴“肺俞”“大椎”“風門”進行研究,發現針灸此3個穴位能明顯降低哮喘模型大鼠血清中IL-13及肺組織中STAT6的陽性表達,證實針灸可以緩解氣道炎癥,降低氣道高反應性,改善氣道重塑,從而改善哮喘。李巍等[12]將92例哮喘患者隨機分為治療組(46例)和對照組(46例),治療組采用電針肺俞穴,對照組口服舒氟美治療,結果顯示電針肺俞穴能顯著提高PEF、FEV1、FVC及FEV1%水平,改善哮喘的喘息、氣短和咳嗽等癥狀,使患者生活質量明顯提高,表明針灸是治療哮喘的一種有效治療方法。

3 蛋白質組學在針灸治療哮喘機制研究中的應用

蛋白質組學技術是從整體的角度分析細胞內動態變化的蛋白質的組成與活動規律,旨在了解這些蛋白質在不同環境和條件下的行為,與中醫的“整體觀念”不謀而合。蛋白質組學技術是揭示生命過程或疾病狀態差異表達蛋白質,預測藥物治療靶點和作用機制的精確方法;是后基因組時代迅速發展的先進組學技術,主要研究某一細胞、組織或生物體在特定階段或生理狀態下蛋白質組成及變化規律,是篩選疾病早期診斷標志物與藥物治療靶點的重要技術手段。

3.1 蛋白質組學與氣道炎癥

鈣結合在哮喘早期炎癥發生的過程中起核心作用,S100蛋白包含兩個EF-hand鈣結合基序,與炎癥密切相關,其中S100A8和S100A9兩種鈣結合蛋白在中性粒細胞和單核細胞溶膠中高度表達[13],誘導多種促炎分子的表達,激活p38或p44/42 MAP激酶和NF-κB等信號通路[6],有實驗證明抑制S100A8和S100A9可減少向肺部遷移的炎癥細胞[14]。CC10蛋白是一種激素誘導的、進化保守的分泌蛋白,屬于分泌紅蛋白家族[15],CC10基因表達降低的大鼠在哮喘發作時,S100A8和S100A9水平也會升高,并伴有免疫球蛋白中的RAGE蛋白水平升高,針灸治療哮喘可能通過抑制這些炎癥相關蛋白發揮作用[16]。蛋白質磷酸化是蛋白質翻譯后修飾的重要內容,金屬硫蛋白-2(MT-2)是一種高金屬離子含量的人類低分子量蛋白,對外界因素敏感,可被激素、細胞因子和氧化劑等高度誘導[17-18],MT-2缺失的小鼠肺中IL-1β和支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞水平顯著升高,抗卵清蛋白抗體水平明顯高于對照組,提示MT-2水平升高可能有助于哮喘的緩解,MT-2與針灸改善哮喘肺功能相關,特異性上調MT-2mRNA表達,MT-2可松弛氣道平滑肌并誘導一系列蛋白質磷酸化,在針灸治療哮喘中起重要作用[16]。

3.2 蛋白質組學與氣道重塑

氣道重塑是哮喘難治的關鍵因素,氣道重塑的主要表現是氣道平滑肌肥大增生,平滑肌細胞促進哮喘纖維增殖性氣道重塑,Akt1是介導MT-2作用的最重要的樞紐蛋白之一,參與哮喘氣道平滑肌的重塑。Akt1磷酸化與氣道平滑肌收縮松弛密切相關,質粒轉導或慢病毒感染導致Akt1過表達,可導致氣道平滑肌細胞增大,蛋白質含量增加,提示Akt1激活可促進哮喘氣道平滑肌肥大[18-19]。MT-2通過增加Akt1在Thr450位點的磷酸化來顯著放松氣道平滑肌細胞,改善氣道重塑的情況。CaMK2β是另一個可被MT-2誘導的重要蛋白,CaMK2是一種多功能激酶,控制細胞的細胞形態、遷移等,CaMK2β作為CaMK2家族的重要成員,參與肌動蛋白的組裝和結構調控,可增強肌球蛋白RLC磷酸化,從而收縮平滑肌,改善氣道重塑,另外,研究發現CaMK2β和Akt1之間存在相關性[19-20]。針灸可以顯著改善哮喘大鼠模型中的肺阻力,Akt1和CaMK2β等蛋白的相關磷酸化變化可能在針灸治療哮喘的療效中發揮重要作用[18]。

3.3 蛋白組學與氣道高反應性

氣道高反應性是由于一系列直接或間接刺激引起的氣道平滑肌收縮增加或功能障礙。有研究表明,AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶,能通過活化一系列不同的下游信號分子來調節細胞生長、凋亡。徐慧等[21]研究發現,哮喘大鼠磷酸化AKT的表達明顯升高,IL-12含量明顯降低,磷酸化AKT蛋白通過上調IL-13、下調IL-12等細胞因子影響Th1/Th2的平衡,表明PI3K/AKT信號通路通過影響Th1/Th2炎性反應因子參與了AHR的過程,T細胞的生理活動是哮喘AHR和炎癥預后的關鍵因素,因為其在免疫病理學和過敏原性之間建立了平衡[7]。胞內磷脂酰肌醇激酶(PI3K)能參與哮喘相關T細胞的發育、活化、增殖及分化,抑制PI3K信號通路可以增強轉錄因子Foxp3的表達,還能使轉錄因子RORγt的表達下降,RORγt/Foxp3的表達優勢發生逆轉,從而實現對哮喘Th17/Treg失衡的調控[22]。針灸治療后Th17細胞的減少能減弱Treg的中和,在T淋巴細胞亞群的變化中,以Th1/Th2和Th17/Treg平衡最為重要,針灸能顯著抑制哮喘大鼠肺組織中STAT3蛋白的表達、促進FOXP3蛋白的表達,從而調節Th17/Treg免疫失衡狀態[23-24]。

4 小結

綜上所述,針灸作為對哮喘的治療具有顯著的臨床療效,但其作用機制尚未明確,通過運用蛋白質組學技術,全面揭示哮喘在蛋白水平的變化趨勢,找出潛在的診斷標志物,預測藥物治療靶點及作用機制,找出針灸的主要作用途徑,為針灸作用的深入研究奠定基礎。因此,基于蛋白質組學的針灸治療哮喘機制研究將為針灸治療哮喘提供重要科學依據。