〔摘要〕 目的 觀察三補(bǔ)方對自然衰老小鼠認(rèn)知功能的影響，探討潛在病理因素和三補(bǔ)方（Sanbu Decoction， SBD）的作用及其可能作用機(jī)制。方法 18只18月齡自然衰老健康SPF級野生型C57BL/6小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為衰老組（WT-Aged）、多奈哌齊組（WT-Donepezil）、三補(bǔ)方組（WT-SBD），另選6只3月齡小鼠為青年對照組（WT-Young）。WT-Young小鼠不灌胃，WT-Aged小鼠用蒸餾水灌胃，其余用相應(yīng)藥物處理，灌胃45 d。灌胃結(jié)束前6日采用水迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄潛伏期時間、穿越平臺次數(shù)和平臺所在象限游泳路程。用HE染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化，免疫組織化學(xué)法測定小鼠腦海馬組織Tau、p-Tau、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）、神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白（neuroepithelial stem cell protein， Nestin）表達(dá)水平，檢測試劑盒檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）活性和丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量。結(jié)果 與WT-Young相比，第2日起WT-Aged逃逸潛伏期延長（Plt;0.05），穿越平臺次數(shù)和平臺所在象限經(jīng)過的路程減少（Plt;0.05）；與WT-Aged相比，WT-Donepezil第3～5日和WT-SDB第4～5日逃逸潛伏期縮短（Plt;0.05），穿越平臺次數(shù)和在平臺所在象限經(jīng)過的路程增多（Plt;0.05）。WT-Aged小鼠出現(xiàn)海馬神經(jīng)元排列紊亂和大面積的神經(jīng)元壞死，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞核固縮、溶解、消失。與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠神經(jīng)元損傷減少，排列較為緊密，退化固縮的細(xì)胞數(shù)量則明顯減少，少部分細(xì)胞可見核固縮及細(xì)胞漿嗜酸性變。與WT-Young相比，WT-Aged Tau、p-Tau和GFAP表達(dá)增多（Plt;0.05），Nestin表達(dá)減少（Plt;0.05），SOD、GSH-Px活性降低（Plt;0.05），MDA含量升高（Plt;0.05）。與WT-Aged相比，WT-Donepezil和WT-SDB p-Tau、GFAP表達(dá)減少（Plt;0.05），WT-SBD SOD、GSH-Px活性升高（Plt;0.05），MDA含量降低（Plt;0.05）。結(jié)論 三補(bǔ)方可以降低自然衰老小鼠腦海馬組織p-Tau表達(dá)，減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞活化水平，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，發(fā)揮腦保護(hù)抗衰老作用，提高老年小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，改善衰老小鼠的衰老狀態(tài)，延緩衰老進(jìn)程。

〔關(guān)鍵詞〕 自然衰老；認(rèn)知功能；脂質(zhì)過氧化損傷；三補(bǔ)方；枸杞子；黃芪；茯苓

〔中圖分類號〕R285" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.03.003

Effects of Sanbu Decoction on cognitive function and lipid

peroxidation damage in naturally aging mice

WANG Xiaoju1，2， WANG Zhixian1，2， ZHANG Wenjiang3， YI Jian1，2， CHEN Bowei1，2， SHENG Wang1，2，

LI Yuxiang1，2， LIU Baiyan4*， WANG Xingkuan1，2

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang， Shaanxi 712046， China; 4. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Sanbu Decoction （SBD） on the cognitive function of naturally aging mice， and to explore the involved potential pathological factors， as well as the action of SBD and its possible mechanism. Methods Eighteen healthy SPF wild-type C57BL/6 naturally aging mice， half female and half male， aged 18 months， were randomized into aging group （WT-Aged）， donepezil group （WT-Donepezil）， SBD group （WT-SBD）， and another six mice aged three months were selected as the young control group （WT-Young）. WT-Young group was not treated. WT-Aged group were treated with distilled water， and the rest groups with corresponding drugs， by gavage for 45 days. During the six days before the end of gavage， Morris water maze test was performed， and the escape latency， platform crossing times， and the swimming distance in the platform quadrant were recorded. HE staining was carried out to observe the morphologic changes of hippocampal neurons of the mice. Immunohistochemistry was applied to measuring the expression levels of Tau， p-Tau， glial fibrillary acidic protein （GFAP）， and neuroepithelial stem cell protein （Nestin） in the hippocampal tissue of the mice. The detection kits were used to check the activity of superoxide dismutase （SOD） and glutathione peroxidase （GSH-Px） and the content of malondialdehyde （MDA）. Results Compared with WT-Young group， the escape latency of WT-Aged group was prolonged from the 2nd day （Plt;0.05）， and the platform crossing times and the swimming distance in the platform quadrant were reduced （Plt;0.05）; compared with WT-Aged group， the escape latency of WT-Donepezil group on the 3rd to 5th day and WT-SBD group on the 4th to 5th day was shortened （Plt;0.05）， and platform crossing times and the swimming distance in the platform quadrant were increased （Plt;0.05）. The hippocampal neurons in WT-Aged group showed disordered arrangement and large areas of necrosis， enhanced acidophilia in the cytoplasm， and pyknosis， dissolution， and disappearance of the nuclei. Compared with WT-Aged group， the hippocampal neurons in WT-Donepezil and WT-SBD groups showed reduced damage and compact arrangement， and the degenerated and pyknotic cells were significantly decreased， with a small minority showing karyopyknosis and cytoplasmic acidophilic change. Compared with WT-Young group， the expressions of Tau， p-Tau， and GFAP in WT-Aged group increased （Plt;0.05）， the expression of Nestin and the activity of SOD and GSH-Px decreased （Plt;0.05）， and the content of MDA was elevated （Plt;0.05）; compared with WT-Aged group， the expressions of p-Tau and GFAP decreased in WT-Donepezil and WT-SBD groups （Plt;0.05）， and the activity of SOD and GSH-Px in WT-SBD group increased （Plt;0.05） while the content of MDA was lowered （Plt;0.05）. Conclusion SBD can reduce the expression of p-Tau in the hippocampus of naturally aging mice， weaken the activation level of astrocytes， and reduce lipid peroxidation， which can improve the learning and memory abilities of senile mice， alleviate their aging state， and delay the aging process， thus playing the roles of brain protection and anti-aging.

〔Keywords〕 natural aging; cognitive function; lipid peroxidation damage; Sanbu Decoction; Gouqizi （Lycii Fructus）; Huangqi （Astragali Radix）; Fuling （Poria）

衰老是多因素影響下機(jī)體各組織器官形態(tài)和功能退變的復(fù)雜生物學(xué)過程，腦是受衰老影響最大的器官之一[1-2]。腦的衰老會破壞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)原有平衡，引起注意力不集中、學(xué)習(xí)和記憶功能下降、決策力和理解力受損等一系列認(rèn)知功能障礙。如任其不管，病情可能會進(jìn)展為阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD），嚴(yán)重時可能會失去語言和認(rèn)知能力，人格和行為發(fā)生改變[3-5]，對社會、家庭和個人都傷害極大，也會成為嚴(yán)重的醫(yī)療衛(wèi)生和社會問題[6-7]。

氧化應(yīng)激脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是腦衰老認(rèn)知障礙的重要病理改變。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）能夠阻斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)，是機(jī)體細(xì)胞抵御ROS損害的第一道防線[8]。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）能夠催化過氧化氫分解，減少氧自由基產(chǎn)生，特異性地降低脂質(zhì)過氧化，從而提高機(jī)體的抗氧化能力。SOD和GSH-Px既能夠通過協(xié)同加強(qiáng)，清除機(jī)體內(nèi)的自由基，又能減輕機(jī)體自由基損傷，還可以協(xié)同降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，共同減輕脂質(zhì)過氧化程度[9-10]。

由于腦衰老進(jìn)展不可逆性及治療效果不佳，如果能夠早期防治，將延緩該病的發(fā)生發(fā)展。中醫(yī)藥在延緩衰老方面具有不可替代的優(yōu)勢，此外，中醫(yī)藥還有毒副作用小、作用靶點(diǎn)多的優(yōu)勢，因此，中醫(yī)藥延緩衰老的作用越來越受到重視。

早期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，三補(bǔ)方（中藥組方枸杞子、黃芪、茯苓）有較好療效，能夠顯著改善腦衰老患者記憶能力，提高生活質(zhì)量[11]。然而，三補(bǔ)方改善認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制尚未可知。因此，本研究采用自然衰老小鼠模擬衰老認(rèn)知功能障礙模型，探索三補(bǔ)方的認(rèn)知改善作用，并研究其可能的作用機(jī)制，以期為三補(bǔ)方的進(jìn)一步研發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1" 實(shí)驗(yàn)動物

健康SPF級野生型C57BL/6小鼠24只，雌雄各半，從南京大學(xué)生物模式中心引入，動物許可證號為SCXK（蘇）2015-0001。課題組自行繁殖后自行鑒定飼養(yǎng)，青年小鼠3月齡，體質(zhì)量為（24±3） g，老年小鼠18月齡，體質(zhì)量為（35±5） g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2） ℃，相對濕度50%，自由飲食進(jìn)水，晝夜光照12 h節(jié)律交替。小鼠的飼養(yǎng)、手術(shù)及取材均嚴(yán)格遵守湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)與管理的相關(guān)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)所有的實(shí)驗(yàn)方案和操作流程遵守動物福利、動物倫理（倫理審查編號：ZYFY20190417-09）及動物保護(hù)等相關(guān)原則和規(guī)定。

1.2" 主要藥品、試劑及儀器

三補(bǔ)方（由枸杞子15 g、黃芪15 g、茯苓10 g組成，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，藥材均符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)（藥材鑒定人為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心藥檢室張?jiān)Ｃ裰魅嗡帋煟畸}酸多奈哌齊[衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20050978，批號：1705078]；Rabbit monoclonal（EPR2605） to Tau（phospho S404）（英國Abcam公司，貨號：ab92676）；monoclonal（E178） to Tau（英國Abcam公司，貨號：ab32057）；Anti-GFAP Antibody（美國Proteintech公司，貨號：16825-1-AP）；Anti-Nestin Antibody（美國Proteintech公司，貨號：19483-1-AP）。SOD測試盒/羥胺法（測總）（貨號：A001-1-1）、MDA測試盒（貨號：A003-1-2）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）（貨號：A005-1-1）均購自南京建成生物工程研究所。Morris水迷宮測試系統(tǒng)（中國成都泰盟軟件有限公司）。

2 方法

2.1" 動物分組、給藥和處理

普通飼料飼養(yǎng)動物至18月齡后開始灌胃。將小鼠分為衰老組（WT-Aged），多奈哌齊組（WT-Donepezil），三補(bǔ)方組（WT-SBD），另取3月齡小鼠為青年對照組（WT-Young），每組6只小鼠，分別做如下處理。WT-Young：普通飼料飼養(yǎng)至3月齡，不灌胃。WT-Aged：普通飼料飼養(yǎng)至18月齡，灌胃等體積蒸餾水。WT-Donepezil：普通飼料飼養(yǎng)至18月齡，灌胃鹽酸多奈哌齊水溶液。WT-SBD：普通飼料飼養(yǎng)至18月齡，灌胃三補(bǔ)方湯藥。按60 kg成人與動物體質(zhì)量藥量折算表換算，即小鼠按10 mL/（kg·d）劑量進(jìn)行灌胃，給藥劑量根據(jù)小鼠每日劑量（g）=成人每日劑量（g）×小鼠體質(zhì)量與體表面積比值/人體質(zhì)量與體表面積比值計(jì)算。WT-SBD給予5.19 g/（kg·d）制備好的湯藥灌胃給藥，WT-Donepezil按0.65 mg/（kg·d）劑量給予鹽酸多奈哌齊溶液灌胃。每日灌胃1次，連續(xù)灌胃45 d。本實(shí)驗(yàn)死亡小鼠1只（為WT-Aged小鼠），解剖發(fā)現(xiàn)巨脾和腹水，可能是小鼠死亡的原因。死亡的小鼠從同品系同月齡小鼠中按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取，進(jìn)行補(bǔ)充，對整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。

灌胃結(jié)束前6日開始行水迷宮實(shí)驗(yàn)，水迷宮測試結(jié)束后處死小鼠取材。采用摘眼球取血法取血后，快速用剪刀剪下小鼠頭部，置于冰凍臺上，低溫降低腦內(nèi)蛋白酶活性。取右半腦的皮質(zhì)與海馬部分裝入標(biāo)記好的EP管內(nèi)，立刻投入液氮速凍，最終轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，待ELISA檢測。左半腦組織進(jìn)行固定后，浸入4%多聚甲醛過夜，再取出行脫水處理，用于HE染色和免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）檢測。

2.2" 檢測指標(biāo)

2.2.1" 行為學(xué)檢測" 運(yùn)用經(jīng)典Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[12]來檢測小鼠對空間方向和位置的學(xué)習(xí)記憶能力。

水迷宮實(shí)驗(yàn)圓筒直徑為120 cm，高為50 cm，將圓筒等分為4個象限并設(shè)置4個入水點(diǎn)，在其中一個象限中固定一個直徑為10 cm的透明平臺，平臺頂端平面位于圓形水池液面以下1 cm。每日隨機(jī)選擇入水點(diǎn)順序，測試環(huán)境及平臺位置保持不變。圓筒內(nèi)的水需要用二氧化鈦[食品添加劑二氧化鈦（漿料型）]染成乳白色，用棍棒攪混至水變成乳白色掩蓋平臺。水池水溫控制在（22±1） ℃，以減少來自水溫的干擾。實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行，5 d訓(xùn)練，1 d測試，共6 d。

水迷宮實(shí)驗(yàn)包括適應(yīng)性訓(xùn)練、定位航行、空間探索實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)開始前1日進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，將小鼠放置在平臺上適應(yīng)15 s，然后把小鼠均依次放于水迷宮中自由游泳60 s，剔除游泳技能不好甚至不會游泳的小鼠。然后進(jìn)行為期5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)，將小鼠快速放入水池。每只小鼠每日每個象限訓(xùn)練1次，每日共4次，訓(xùn)練歷時5 d。在60 s內(nèi)找到平臺后停留10 s，若未找到平臺，則用網(wǎng)兜引導(dǎo)小鼠至平臺停留10 s。記錄小鼠第1次找到平臺的時間。

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將平臺撤除，開始進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。依次將小鼠分別從原平臺所在對側(cè)象限放入水中，記錄60 s內(nèi)小鼠逃逸潛伏期、穿越平臺位置的次數(shù)、游行原平臺所在區(qū)域時間、小鼠的游泳速度、運(yùn)動軌跡、各象限停留時間和路程等參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中選用60 s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)、在原平臺象限內(nèi)停留的路程和軌跡為評估指標(biāo)。

2.2.2" HE染色" 每組選小鼠左側(cè)腦半球，用4%多聚甲醛在4 ℃固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋，分離海馬組織，制作石蠟切片（5 μm厚）。切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水合后，對切片進(jìn)行HE染色，再封片待顯微鏡觀察。

2.2.3" 小鼠腦組織IHC染色" 每組選小鼠左側(cè)腦半球，用4%多聚甲醛在4 ℃固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋，分離海馬組織，制作石蠟切片（5 μm厚）。先將切片脫蠟至水，再進(jìn)行熱修復(fù)抗原；待熱修復(fù)抗原完成后，進(jìn)一步滅活內(nèi)源性酶。分別孵育一抗、二抗，再行DAB顯色；再用蘇木精復(fù)染并各級乙醇脫水，上述步驟完成后，取出后置于二甲苯中10 min，兩次，再用中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

2.2.4" ELISA試劑盒檢測SOD、GSH-Px、MDA" 取凍存小鼠腦組織勻漿、于2～8 ℃ 5 000×g離心5 min，取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，或?qū)⑸锨宸盅b保存于-20 ℃或

-80 ℃，解凍后的樣本應(yīng)再次離心，然后檢測，避免反復(fù)凍融。按照試劑盒說明書進(jìn)行各試劑配制，腦組織樣本按照SOD、GSH-Px、MDA不同指標(biāo)的說明書進(jìn)行操作，操作完成后讀取并記錄數(shù)據(jù)。

2.3" 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料用“x±s”表示，GraphPad Prism 6.0作圖軟件作圖。多組比較用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD法，方差不齊者用Games Howell法。以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采像為普通的點(diǎn)采像，倍數(shù)為40×40倍和10×10倍，圖像分析軟件為IPP（Image-Pro-Plus）。

3 結(jié)果

3.1" 動物一般情況

青年小鼠灰黑色毛發(fā)順滑亮澤，腹肌緊收，攝食飲水正常、日常行為及反應(yīng)較為敏捷，精神狀態(tài)良好。老年小鼠毛發(fā)比青年小鼠粗糙、發(fā)灰、枯燥，甚至有脫毛現(xiàn)象，部分倦怠慵懶、反應(yīng)遲鈍，部分易激怒，精神狀態(tài)較青年小鼠差，藥物灌胃治療后均有所改善。

3.2" 水迷宮實(shí)驗(yàn)

3.2.1" 定位航行實(shí)驗(yàn)" 與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠花費(fèi)更多的時間搜索平臺，各組小鼠主要圍繞水池邊緣探索式游泳，找到水中隱匿平臺后，小鼠慢慢學(xué)會有意識尋找平臺，出現(xiàn)直驅(qū)式搜索情況；與WT-Young相比，第2日起WT-Aged逃逸潛伏期延長（Plt;0.05）；第3～5日，與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil小鼠逃逸潛伏期縮短（Plt;0.05），第4～5日，WT-SDB小鼠逃逸潛伏期縮短（Plt;0.05）。詳見圖1。

3.2.2" 空間探索實(shí)驗(yàn)" 與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠穿越平臺次數(shù)和在平臺所在象限經(jīng)過的路程減少（Plt;0.05）；與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠穿越平臺次數(shù)和在平臺所在象限經(jīng)過的路程增多（Plt;0.05）。詳見圖1。

3.3" 三補(bǔ)方對自然衰老小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響

WT-Young小鼠CA1區(qū)海馬神經(jīng)元多達(dá)3～4層，排列緊密有序，細(xì)胞核和細(xì)胞漿清晰可見。與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂，海馬CA1區(qū)出現(xiàn)大面積的神經(jīng)元壞死，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞核固縮、溶解、消失。與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠神經(jīng)元損傷減少，排列較為緊密，退化固縮的細(xì)胞數(shù)量則明顯減少，少部分細(xì)胞可見核固縮及細(xì)胞漿嗜酸性變。詳見圖2。

3.4" 三補(bǔ)方對自然衰老小鼠腦內(nèi)海馬神經(jīng)元Tau蛋白和p-Tau蛋白的影響

與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠Tau蛋白表達(dá)增多（Plt;0.05）；與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠Tau蛋白表達(dá)減少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠p-Tau蛋白表達(dá)增多（Plt;0.05）；與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠p-Tau蛋白表達(dá)減少（Plt;0.05）。詳見圖3。

3.5" 三補(bǔ)方對自然衰老小鼠腦內(nèi)GFAP、Nestin的影響

與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠GFAP表達(dá)升高（Plt;0.05）；與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠GFAP表達(dá)降低（Plt;0.05）。與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠Nestin表達(dá)減少（Plt;0.05）；與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠Nestin蛋白表達(dá)增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。詳見圖4。

3.6" 三補(bǔ)方對自然衰老小鼠腦組織脂質(zhì)過氧化損傷的影響

與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高（Plt;0.05）。與WT-Aged小鼠相比，WT-SDB小鼠SOD、GSH-Px活性升高（Plt;0.05），MDA含量降低（Plt;0.05）。詳見圖5。

4 討論

中醫(yī)學(xué)無腦衰老病名，根據(jù)臨床特點(diǎn)，腦衰老可歸屬于“健忘”“呆病”“失神”等疾病范疇，屬于老年人高發(fā)疾病。本課題組基于前期研究[11]認(rèn)為，腦衰老總屬腎精虧損、肺氣虛衰、脾運(yùn)失健三者交雜以致?lián)p及髓海、傷及清竅、蒙于元神而發(fā)病，據(jù)此提出“滋腎精、補(bǔ)肺氣、健脾運(yùn)”之法用于健腦抗衰，創(chuàng)治三補(bǔ)方有較好臨床療效。方中枸杞子能滋補(bǔ)肝腎、益智安神，《本草匯言·卷十》言枸杞子“有十全之妙用”而能達(dá)“壯精益神，神滿精足”之功，故為方中君藥。黃芪為“補(bǔ)氣諸藥之最”，為臣藥，《本草綱目·黃耆》云：“黃芪甘溫純陽，其用有五：補(bǔ)諸虛不足，一也；益元?dú)猓玻粔哑⑽福玻蝗ゼ幔囊玻慌拍撝雇矗钛瑑?nèi)托陰疽，為瘡家圣藥，五也。”茯苓可健運(yùn)中焦，能助君藥入腎補(bǔ)益真元，又助飲食水谷精微滋先天以生腦髓，并可將髓海之痰濁引而下行，腦竅得以清明，故為佐藥。三藥合用，脾化健運(yùn)，肺氣固密，腎精充盛，精血充旺，既可培補(bǔ)先天，又能滋養(yǎng)后天，使髓海充足，則腦實(shí)神全。現(xiàn)代研究表明，氧化應(yīng)激脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是腦衰老的重要致病因素，機(jī)體隨著年齡增長，抗脂質(zhì)過氧化能力下降，容易造成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸積累以及細(xì)胞凋亡，從而加速腦組織衰老，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶能力減退[13-14]。黃芪[15-17]、枸杞子[18]、茯苓[19-20]具有抗衰老、抗氧化等生物活性作用，可以提高血清中SOD活性，降低MDA含量，增強(qiáng)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

p-Tau形成的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NET）是衰老認(rèn)知障礙的主要病理標(biāo)志物之一。Tau蛋白的生物活性主要由其磷酸化程度來調(diào)控，過度磷酸化的Tau蛋白穩(wěn)定性降低，與微管的結(jié)合能力下降，并從微管上解離下來，聚集成成對的螺旋纖維絲狀結(jié)構(gòu)，沉積聚集在神經(jīng)細(xì)胞的微絲中形成NET，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，觸發(fā)神經(jīng)元凋亡增加，導(dǎo)致AD等神經(jīng)變性疾病的發(fā)生。星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)病理過程及神經(jīng)元保護(hù)中都具有非常重要的作用。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性表達(dá)標(biāo)志物。隨著機(jī)體衰老及伴隨的中樞神經(jīng)系統(tǒng)老化過程中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，GFAP活性增強(qiáng)，對氧化應(yīng)激損傷也非常敏感。Nestin的表達(dá)與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)，常被用作神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，是神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的標(biāo)志物，其活化可能是對神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷或炎癥的一種反應(yīng)，可能影響神經(jīng)元和其他細(xì)胞類型。隨著機(jī)體衰老及伴隨的中樞神經(jīng)系統(tǒng)老化，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，GFAP活性增強(qiáng)，對氧化應(yīng)激損傷也非常敏感。神經(jīng)干細(xì)胞可能在神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)和再生中發(fā)揮作用，但其功能可能受到各種因素的調(diào)控，Nestin的表達(dá)與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)，常被用作神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，是神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的標(biāo)志物[21]。

本研究結(jié)果說明自然衰老模型小鼠存在認(rèn)知功能減退，由黃芪、枸杞子、茯苓組方而成的SBD可以顯著改善認(rèn)知障礙小鼠受損的學(xué)習(xí)記憶能力。HE和IHC結(jié)果表明，SBD治療還可以減少腦組織p-Tau表達(dá)，降低GFAP的活性，減少衰老相關(guān)蛋白對腦組織的損害作用，從而發(fā)揮保護(hù)老年小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。SBD提高了SOD和GSH-Px活性，降低了MDA含量，體現(xiàn)了SBD在衰老小鼠腦內(nèi)的抗氧化應(yīng)激作用。

三補(bǔ)方對自然衰老小鼠認(rèn)知功能及脂質(zhì)過氧化損傷的影響機(jī)制流程詳見圖6。

5 結(jié)論

隨著人口老齡化程度的加劇，衰老及其帶來的機(jī)體改變引起廣泛關(guān)注。其中，腦衰老引起的認(rèn)知功能障礙會為患者及其家庭帶來極大的負(fù)擔(dān)。因此，及早預(yù)防、及早治療、延緩病程進(jìn)展具有重大意義。三補(bǔ)方為臨床驗(yàn)方，能通過降低自然衰老小鼠腦海馬組織p-Tau表達(dá)，減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞活化水平，抑制與腦衰老認(rèn)知障礙的重要病理環(huán)節(jié)——脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改善小鼠認(rèn)知功能，延緩衰老進(jìn)程，發(fā)揮腦保護(hù)作用，可為臨證診治腦衰老認(rèn)知功能障礙提供一定的中醫(yī)藥治療思路。

參考文獻(xiàn)

[1] 李" 雪， 孫君志， 金" 毓， 等. 運(yùn)動干預(yù)腦衰老： 新進(jìn)展與再認(rèn)識[J]. 科技導(dǎo)報(bào)， 2022， 40（10）： 49-59.

[2] 王沐晨， 單" 思， 高" 鵬， 等. 基于腸道菌群探討中醫(yī)藥抗衰老作用的研究進(jìn)展[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2023， 38（2）： 718-721.

[3] MARTINS R N， VILLEMAGNE V， SOHRABI H R， et al. Alzheimer's disease： A journey from amyloid peptides and oxi?dative stress， to biomarker technologies and disease prevention strategies-gains from AIBL and DIAN cohort studies[J]. Journal of Alzheimer's Disease， 2018， 62（3）： 965-992.

[4] CHIN-CHAN M， NAVARRO-YEPES J， QUINTANILLA-VEGA B. Environmental pollutants as risk factors for neurodegenerative disorders： Alzheimer and Parkinson diseases[J]. Frontiers in Cellu?lar Neuroscience， 2015， 9： 124.

[5] 杜正彩， 胡潤華， 李瑞林， 等. 治療阿爾茨海默病中藥化學(xué)成分及機(jī)制的研究概況[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2024， 30（5）： 236-245.

[6] BUTTERFIELD D A， BOYD-KIMBALL D. Oxidative stress， amyloid-β peptide， and altered key molecular pathways in the pathogenesis and progression of Alzheimer's disease[J]. Journal of Alzheimer's Disease， 2018， 62（3）： 1345-1367.

[7] 商曉康， 張思萌， 倪軍軍. 組織蛋白酶B參與腦衰老及阿爾茲海默癥發(fā)生發(fā)展研究進(jìn)展[J]. 遺傳， 2023， 45（3）： 212-220.

[8] BALENDRA V， SINGH S K. Therapeutic potential of astaxanthin and superoxide dismutase in Alzheimer's disease[J]. Open Biology， 2021， 11（6）： 210013.

[9] WANG W Z， YIN J， MA X P， et al. Inhibition of mitochondrial fragmentation protects against Alzheimer's disease in rodent model[J]. Human Molecular Genetics， 2017， 26（21）： 4118-4131.

[10] 曹玉成， 王" 哲， 宋煒熙. 補(bǔ)腎填髓方對阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及線粒體氧化應(yīng)激的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2019， 39（4）： 459-464.

[11] 王小菊， 樸美虹， 王智賢， 等. 三補(bǔ)方治療遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙脾腎兩虛證的臨床觀察[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2021， 27（10）： 80-84.

[12] BéLANGER M， ALLAMAN I， MAGISTRETTI P J. Brain energy metabolism： Focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation[J]. Cell Metabolism， 2011， 14（6）： 724-738.

[13] CUI Z F， ZHAO X T， AMEVOR F K， et al. Therapeutic application of quercetin in aging-related diseases： SIRT1 as a potential mechanism[J]. Frontiers in Immunology， 2022， 13： 943321.

[14] MICHEL M， BENíTEZ-BUELGA C， CALVO P A， et al. Small-molecule activation of OGG1 increases oxidative DNA damage repair by Gaining a new function[J]. Science， 2022， 376（6600）： 1471-1476.

[15] 傅曉燕， 雷珊珊， 李雄英. 黃芪配方顆粒對衰老大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制初探[J]. 中藥材， 2017， 40（5）： 1184-1189.

[16] 奚佳玉， 蘇圓錦， 趙鯤鵬， 等. 黃芪藥食同源的研究進(jìn)展[J]. 華西藥學(xué)雜志， 2023， 38（6）： 718-724.

[17] 楊淑惠， 王雨萌， 尹佳婷， 等. 基于不同模式生物評價(jià)黃芪的抗衰老作用[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2023， 39（9）： 827-838.

[18] 葉紅霞， 齊妍強(qiáng)， 賀穎西， 等. 肉蓯蓉總苷與枸杞多糖配伍對不同月齡C57BL/6J小鼠促智作用的研究[J]. 中藥材， 2023， 46（1）： 217-221.

[19] 馮" 敏， 郟自明， 萬" 鳴， 等. 茯苓改善小鼠學(xué)習(xí)記憶功能作用的研究[J]. 食品研究與開發(fā)， 2021， 42（19）： 13-18.

[20] 梁亦龍， 曾垂省， 王" 允， 等. 茯苓多糖的抗氧化作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 40（7）： 288-289.

[21] CHATTERJEE P， PEDRINI S， ASHTON N J， et al. Diagnostic and prognostic plasma biomarkers for preclinical Alzheimer's disease[J]. Alzheimer's amp; Dementia， 2022， 18（6）： 1141-1154.