?‘克新13號(hào)’馬鈴薯植株再生和轉(zhuǎn)化技術(shù)

摘要：為研究馬鈴薯植株再生和轉(zhuǎn)化技術(shù)，以‘克新13號(hào)’的莖段、葉片和微型薯為外植體，接種到不同激素配比的培養(yǎng)集中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和分化，再采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，初步建立了馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化再生體系。結(jié)果表明：莖段是‘克新13號(hào)’馬鈴薯比較理想的外植體材料，最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為4.4 g/L MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L KT，愈傷組織誘導(dǎo)率在95%以上；最佳的分化培養(yǎng)基為4.4 g/L MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+2 mg/L 6-BA+3 mg/L KT+0.5 mg/L GA3+0.1 g/L 肌醇，出苗率為56.25%；外植體預(yù)培養(yǎng)2 d后，用OD600=0.5的農(nóng)桿菌菌懸液侵染7 min，再共培養(yǎng)3 d，以50 mg/L Kan和 200 mg/L Tim為抗生素進(jìn)行篩選，能成功獲得含目的基因Cas9p的轉(zhuǎn)化植株。

關(guān)鍵詞： 馬鈴薯；克新13號(hào)；植株再生；轉(zhuǎn)化體系

中圖分類號(hào)：S532；Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2024）01-0007-07

Plant Regeneration and Transformation of the Potato Cultivar 'Kexin No. 13'

MA Wen-ke，ZHU Yu-ying，CHEN Zhao-gui，LI Xi-tao，LIN Yan-wen，LEI Jia

（School of Life Science， Huizhou University， Huizhou 516007， PRC）

Abstract： This study aims to explore the potato plant regeneration and transformation technology. The stem segment， leaf， and minituber of 'Kexin No. 13' were used as explants and inoculated into the media with different plant hormone ratios for callus induction and differentiation. Furthermore， the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method was employed to establish a genetic transformation and regeneration system for potatoes. The results showed that the stem segment was the ideal explant of 'Kexin No. 13'. The optimal medium for callus induction was 4.4 g/L MS + 30 g/L sucrose + 8 g/L agar + 2 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L 2，4-D + 0.4 mg/L KT， in which the callus induction rate reached above 95%. The optimal differentiation medium was 4.4 g/L MS + 30 g/L sucrose + 8 g/L

agar + 2 mg/L 6-BA + 3 mg/L KT + 0.5 mg/L GA3 + 0.1 g/L inositol， in which the emergence rate was 56.25%. The transformation experiment was carried out in a procedure of explant pre-culture for 2 d， soaking in the A. tumefaciens suspension （OD600=0.5） for 7 min， and co-culture for 3 d. Subsequently， 50 mg/L kanamycin and 200 mg/L timentin were used for screening of the seedlings carrying the target gene Cas9p.

Key words：potato; 'Kexin No. 13'; plant regeneration; transformation system

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是全球第四大糧食作物，我國(guó)是世界上馬鈴薯種植面積最大的國(guó)家，馬鈴薯生產(chǎn)在保障國(guó)家糧食安全中發(fā)揮了重要作用[1]。培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的馬鈴薯新品種一直是育種界努力的方向，近年來(lái)利用基因編輯技術(shù)進(jìn)行遺傳改良已成為馬鈴薯分子育種的有效手段[2]。而建立高效且穩(wěn)定的植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系是開(kāi)展馬鈴薯分子育種的前提。

目前，馬鈴薯植株再生體系的研究主要集中在外植體的種類、激素的濃度配比、基因型和培養(yǎng)條件等方面[3-6]。胡霞等[7]研究表明，在MS + 2.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA + 3 mg/L GA3 + 0.5 mg/L"2，4-D 的培養(yǎng)基上，馬鈴薯莖段愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)90%以上，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。侯丁一等[8]成功探索了費(fèi)烏瑞它、克新1號(hào)、夏坡蒂3個(gè)品種的塊莖以及大田薯的再生體系，其中克新1號(hào)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基最佳激素濃度配比為1 mg/L IAA+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3+2 mg/L ZT，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)95.83%。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系方面，研究較多的是轉(zhuǎn)化外植體、基因型、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、抗生素種類及濃度等[9-12]。張麗等[10]研究表明，馬鈴薯對(duì)卡那霉素（Kan）很敏感，Kan濃度過(guò)低時(shí)選擇壓力不足，Kan濃度過(guò)高時(shí)不利于后續(xù)分化，在其研究的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中Kan的濃度應(yīng)控制在50～100 mg/L。朱英等[13]、李傳龍等[14]研究認(rèn)為，外植體的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間以2～4 d為宜，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間以2～3 d為宜，侵染液的農(nóng)桿菌濃度以O(shè)D600=0.5、侵染時(shí)間以5～10 min為宜。農(nóng)桿菌Vir基因可受乙酰丁香酮的誘導(dǎo)而活化表達(dá)，因此分別在農(nóng)桿菌侵染階段和愈傷組織分化階段加入0.004%的乙酰丁香酮將有利于提高轉(zhuǎn)化率。宋倩娜等[15]以‘并薯6號(hào)’的莖段為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最終篩選的適宜條件為：外植體預(yù)培養(yǎng)2 d后，在MS +"2.0 mg/L6-BA + 0.5 mg/L 2，4-D + 0.4 mg/L KT的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率為86.7%；經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織在MS + 1 mg/L 6-BA+ 1 mg/L GA3+ 1 mg/L"ZT的培養(yǎng)基上進(jìn)行分化；用200 mg/L的特美汀（Timentin，Tim）作農(nóng)桿菌抑制劑，在愈傷組織誘導(dǎo)、分化及生根階段都加入Tim。

盡管有關(guān)馬鈴薯植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道較多，但不同馬鈴薯品種之間的植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率差異較大，沒(méi)有統(tǒng)一的體系。研究以‘克新13號(hào)’馬鈴薯為研究對(duì)象，擬用莖段、葉片和微型薯為外植體材料，探索其適宜的愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基，并在此基礎(chǔ)上對(duì)以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，以期為后續(xù)開(kāi)展基因編輯技術(shù)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 外植體 供試的‘克新13號(hào)’馬鈴薯由黑龍江

農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，誘導(dǎo)獲取試管苗后供應(yīng)后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 供試農(nóng)桿菌 供試的根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105，基因編輯基礎(chǔ)載體pYLCRISPR/Cas935s-N由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，其中包含有卡那霉素抗性基因（抗性篩選標(biāo)記基因）和Cas9p基因（圖1），sgRNA表達(dá)盒由本課題組構(gòu)建。

1.1.3 培養(yǎng)基 以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，根據(jù)6-芐氨基嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）、激動(dòng)素（KT）、α-萘乙酸（NAA）的所含比例進(jìn)行調(diào)整，植株再生試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基命名和成份如表1所示。轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基是在植株再生培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入卡那霉素（Kan）和特美汀（Tim）2種抗生素，如表2所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試管苗獲取及繼代擴(kuò)繁 將供試馬鈴薯放置至發(fā)芽，將幼芽用8%次氯酸鈉消毒后接種于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～4周后將試管苗進(jìn)行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度 2 000 lx、光照時(shí)間16 h，溫度為（24±2）℃，后續(xù)試驗(yàn)培養(yǎng)條件相同。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 以擴(kuò)繁苗齡為4周的試管苗為材料，把莖段、葉片和微型薯作為外植體材料接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每組設(shè) 2 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10～15個(gè)外植體。20 d后計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率，把誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基命名為CIM。愈傷誘導(dǎo)率（%）=形成愈傷組織外植體數(shù)/總外植體數(shù)量×100。

1.2.3 誘導(dǎo)外植體分化及生根培養(yǎng) 把培養(yǎng)20 d并形成愈傷組織的外植體，移接到不同的分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織分化成苗。每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種15個(gè)外植體。20 d后統(tǒng)計(jì)出苗率。出苗率（%）=出苗的外植體數(shù)/總外植體數(shù)量×100。確定適合的分化培養(yǎng)基配方命名為SIM。剪下誘導(dǎo)分化出的不定芽，形態(tài)學(xué)下端朝下插在生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 農(nóng)桿菌培養(yǎng)及活化 （1）農(nóng)桿菌培養(yǎng)：把保存的農(nóng)桿菌接種到加有50 mg/L Kan的LB平板上，28℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)3 d，待生長(zhǎng)出菌落。（2）農(nóng)桿菌活化：①取25 mL的離心管，把含有50 mg/L Kan的液體LB吸取5 mL加入離心管，挑取單菌落接種到離心管中，200 r/min，28℃，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)2 d。②取50 mL的離心管，把含有50 mg/L

Kan的液體LB吸取40 mL加入離心管，吸取50 μL小離心管中的菌液加到大號(hào)離心管中，剩余菌液置于4℃冰箱中保存。大號(hào)離心管200 r/min，28℃，黑暗條件下震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.5 外植體侵染及共培養(yǎng) （1）預(yù)培養(yǎng)。剪取外植體接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d。（2）侵染液制備：將活化后的菌液，5 000 r/min離心8 min，倒去上清液，用MS重懸菌體將菌液稀釋到OD600=0.5的濃度。（3）侵染及共培養(yǎng)：將預(yù)培養(yǎng)的莖段和葉片以及無(wú)需預(yù)培養(yǎng)的微型薯，在農(nóng)桿菌懸浮液中侵染7 min，侵染時(shí)緩慢顛倒搖晃；侵染后外植體用滅菌水洗滌3次，在滅菌濾紙上吸干多余水分，轉(zhuǎn)入鋪有一層無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)基上，在溫度為（24±2）℃，黑暗條件下共培養(yǎng)3 d。

1.2.6 誘導(dǎo)愈傷組織 將共培養(yǎng)之后的外植體轉(zhuǎn)入到含有不同激素濃度以及抗生素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)15～20 d。

1.2.7 誘導(dǎo)分化 把培養(yǎng)20 d形成愈傷組織的外植體移接到分化培養(yǎng)基中分化不定芽。將誘導(dǎo)分化出的不定芽形態(tài)學(xué)下端向下插入含有50 mg/L Kan和50 mg/L Tim的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.8 分子鑒定 （1）DNA提取。取對(duì)照試管苗、轉(zhuǎn)化植株、轉(zhuǎn)化愈傷組織等材料，利用CTAB法提取DNA，將提取好的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃?）PCR擴(kuò)增。把含植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化試管苗DNA作為陰性對(duì)照，用NPTII F（5′–GTCAAGACCGACCTGTCCGGTG–3′）、NPTII R（5′–TCCACCATGATATTCGGCAAGC–3′）和質(zhì)粒Cas9p F（5′–CTACTCCGTCCTCGTGGTCG–3′）、Cas9p R（5′–CTTGTCGAGGTTAGCGTC AG–3′）這2對(duì)引物對(duì)各模版DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：模板DNA 1 μL，PCRMix 13 μL，引物各1 μL，雙蒸水9 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃復(fù)性10 min。NPTII基因片段大小為452 bp、Cas9p基因片段大小為448 bp。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳外植體和愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

愈傷組織的誘導(dǎo)率和質(zhì)量跟激素濃度配比有關(guān)，不同的外植體誘導(dǎo)效率也存在影響。將莖段、葉片、微型薯分別接種到激素濃度不同的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果（圖2和表3）表明，接種5 d時(shí)，莖段兩端就開(kāi)始膨脹變大，并出現(xiàn)愈傷組織，在不同激素配比的培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率均在95%以上，且愈傷組織致密，生長(zhǎng)旺盛；雖然微型薯在3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率均達(dá)100%，但由于微型薯表面生長(zhǎng)點(diǎn)原因，如處理不好，在分化時(shí)生長(zhǎng)點(diǎn)提前出苗將嚴(yán)重影響試驗(yàn)；而葉片在3種培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率均較低，不宜作為外植體材料，主要是因?yàn)槿~片在培養(yǎng)過(guò)程中容易枯萎，細(xì)胞死亡。而在外植體材料相同的條件下，C2和C3培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)茂盛且致密，多呈黃綠色、淡黃色，在后續(xù)培養(yǎng)階段也有較好的生長(zhǎng)狀況，無(wú)明顯褐化現(xiàn)象，愈傷組織誘導(dǎo)率在95%以上（葉片外植體除外）；C1培養(yǎng)基雖也有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，但與C2、C3相比誘導(dǎo)周期長(zhǎng)，且后期出現(xiàn)了較明顯的褐化現(xiàn)象。綜合比較認(rèn)為，對(duì)于‘克新13號(hào)’馬鈴薯來(lái)講，莖段是比較理想的外植體材料，最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為C2（4.4 g/L MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L KT）。

2.2 最佳分化培養(yǎng)基的篩選結(jié)果及幼苗生根情況

將愈傷組織接種到2種分化培養(yǎng)基中，20 d后觀測(cè)分化結(jié)果，由表4可知，S1培養(yǎng)基的出苗率為56.25%，S2培養(yǎng)基的出苗率為41.74%，說(shuō)明在分化培養(yǎng)基中加入一定量的肌醇可促進(jìn)不定芽的分化和生長(zhǎng)，縮短培育周期。

2.3 馬鈴薯植株的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果

以莖段為外植體，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)后將外植體接種到2種培養(yǎng)基（ZC1、ZC2）上誘導(dǎo)愈傷組織，培養(yǎng)20 d后，均可以獲得愈傷組織，誘導(dǎo)率均在95%左右。將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種到不同的培養(yǎng)基進(jìn)行分化，結(jié)果如表5和圖4所示。在ZS1培養(yǎng)基中分化的愈傷組織，外植體生長(zhǎng)狀況良好，大多數(shù)外植體呈綠色，少部分外植體呈淡黃色，能誘導(dǎo)出不定芽，出苗率為36.36%，將不定芽接種到含有抗生素的生根培養(yǎng)能正常生根（圖5）；在ZS2培養(yǎng)基中，外植體大多數(shù)呈黃色，基本無(wú)法分化出不定芽。

2.4 影響轉(zhuǎn)化效果的各因素

2.4.1 預(yù)培養(yǎng) 共培養(yǎng)前進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，有利于調(diào)整外植體的生理狀態(tài)，使其經(jīng)受得住后續(xù)農(nóng)桿菌的侵染而不死亡。試驗(yàn)針對(duì)‘克新13號(hào)’馬鈴薯優(yōu)化設(shè)置預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)2 d時(shí)，有效控制了愈傷組織的褐化現(xiàn)象（圖6）。

2.4.2 農(nóng)桿菌濃度 農(nóng)桿菌濃度對(duì)轉(zhuǎn)化也有較大的影響，菌濃度過(guò)低會(huì)使得轉(zhuǎn)化率低或是無(wú)法成功轉(zhuǎn)化，菌濃度過(guò)高會(huì)使得后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)農(nóng)桿菌的污染，導(dǎo)致外植體死亡。在優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將侵染菌懸液濃度設(shè)置為OD600=0.5，有效降低了轉(zhuǎn)化后愈傷組織被農(nóng)桿菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)獲得到了轉(zhuǎn)化后的幼小植株。

2.5 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)轉(zhuǎn)化獲得的植株進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果如圖7所示，轉(zhuǎn)化后的愈傷組織和幼小植株在450 bp處出現(xiàn)了明亮條帶，與陽(yáng)性對(duì)照大小一致，表明轉(zhuǎn)化后的愈傷組織和植株中包含了目的基因Cas9p，成功獲得了含Cas9p基因的轉(zhuǎn)化植株。

3 討論

3.1 不同激素配比對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)及分化的影響

在馬鈴薯愈傷組織的誘導(dǎo)及分化過(guò)程，激素配比是最為主要的影響因素，不同基因型的馬鈴薯使用的激素種類和濃度配比存在差異[16-17]。試驗(yàn)以‘克新13號(hào)’為材料，采用莖段、葉片和微型薯為外植體，對(duì)比了不同激素配比的誘導(dǎo)效果，最終確定最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為4.4 g/L MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L"KT，最佳的分化培養(yǎng)基配方為4.4 g/L MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+2 mg/L 6-BA+3 mg/L KT+0.5 mg/L GA3+0.1 g/L肌醇。齊恩芳[18]的研究表明，6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化有較大的促進(jìn)作用，在不含6-BA的培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)慢，易生根但不成苗；2，4-D可促進(jìn)愈傷組織的形成，但卻會(huì)抑制愈傷組織的分化；肌醇雖不是植物激素，但其可以促進(jìn)植株代謝活動(dòng)，有利于愈傷組織的生長(zhǎng)和不定芽的分化。劉衛(wèi)平等[19]研究結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基中不添加肌醇，會(huì)使得愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，分化率降低。

3.2 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯愈傷組織轉(zhuǎn)化效率的因素

影響轉(zhuǎn)化效率的因素很多，包括基因型、外植體類型、培養(yǎng)基及激素配比、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、抗生素種類和濃度等[20-21]。馬鈴薯基因型對(duì)轉(zhuǎn)化效率有較大的影響，該研究中‘克新13號(hào)’馬鈴薯莖段的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到95%以上，且愈傷組織生長(zhǎng)良好，后續(xù)分化效果也較高，是一個(gè)適合利用基因編輯技術(shù)開(kāi)展遺傳轉(zhuǎn)化研究的馬鈴薯材料。

預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于馬鈴薯轉(zhuǎn)化也有一定的影響，未進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，均會(huì)導(dǎo)致外植體后期出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，難以形成愈傷組織，無(wú)法獲得轉(zhuǎn)化植株[10]。共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則容易被農(nóng)桿菌污染導(dǎo)致外植體死亡，共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短則會(huì)造成轉(zhuǎn)化率低，難以獲得含目的基因的轉(zhuǎn)化植株[21]。另外，還需注意農(nóng)桿菌侵染液的濃度和侵染時(shí)間[9]。農(nóng)桿菌濃度過(guò)高或侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)試驗(yàn)出現(xiàn)農(nóng)桿菌大量繁殖，造成外植體死亡；農(nóng)桿菌濃度過(guò)低或侵染時(shí)間過(guò)短，則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低，從而無(wú)法獲得含目的基因的植株。

抗生素在轉(zhuǎn)化過(guò)程中主要起到篩選和抑菌的作用，濃度低則達(dá)不到抑菌的效果，使農(nóng)桿菌過(guò)度繁殖造成污染，而導(dǎo)致外植體死亡；濃度過(guò)高則會(huì)影響愈傷組織生長(zhǎng)，不利于誘導(dǎo)分化成苗。宋倩娜等[15]的研究表明，同濃度的Tim和Cef，Tim的篩選效果優(yōu)于Cef，且較低濃度就可達(dá)到良好的抑菌效果。齊恩芳等[18]指出，不同生長(zhǎng)階段的外植體對(duì)卡那霉素的敏感性不同，誘導(dǎo)愈傷組織和誘導(dǎo)芽分化階段以50 mg/L的選擇壓較為適宜，抗性再生芽生根階段以75 mg/L為宜。

試驗(yàn)結(jié)果表明，外植體預(yù)培養(yǎng)2 d后，用OD600=0.5的農(nóng)桿菌菌懸液侵染7 min，再共培養(yǎng)3 d，以50 mg/L Kan和 200 mg/L Tim為抗生素進(jìn)行篩選，能成功地獲得含目的基因Cas9p的轉(zhuǎn)化植株。

參考文獻(xiàn)：

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