4種植物葉提取液對青枯雷爾氏菌抑菌活性研究

摘 要：青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum是一種毀滅性土傳病害病原菌，防治困難，通過抑菌圈、抑菌率、最小抑菌濃度測定，探討羊蹄甲、三裂蟛蜞菊、馬纓丹、芒果葉提取液對青枯菌的抑制效果。結果表明：三裂蟛蜞菊葉提取液的抑菌效果最好，抑菌圈范圍為15.00～18.13 mm，為高度敏感，在0.40 g·mL-1濃度處理下，其抑菌率達到79.63%，顯著高于其他處理組；羊蹄甲和馬纓丹葉提取液的抑菌圈范圍為10.67～15.57 mm，為中度敏感，抑菌率分別為58.33%和60.37%；芒果葉提取液的抑菌效果最差。

關鍵詞：植物源殺菌劑；青枯雷爾氏菌；粗提物；抑菌活性；抑菌圈

中圖分類號：S 476.1 ""文獻標志碼：A ""文章編號：0253-2301（2024）01-0018-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.01.003

Study on the Antibacterial Activity of the Extracts from 4 Kinds ofPlant Leaves Against Ralstonia solanacearum

Abstract： Ralstonia solanacearum is a devastating soil-borne pathogen， which is difficult to control. The inhibition effects of the extracts from Bauhinia purpurea， Sphagneticola trilobata， Lantana camara and Mangifera indica leaves on Ralstonia solanacearum were investigated by measuring the inhibition zone， antibacterial rate and minimal inhibitory concentration. The results showed that the antibacterial effect of the extract from Sphagneticola trilobata leaves was the best， and the inhibition zone ranged from 15.00 mm to 18.13 mm， which was highly sensitive. The antibacterial rate reached 79.63% at the concentration of 0.40 g·mL-1， which was significantly higher than that of other treatment groups. The inhibition zone of the extract from Bauhinia purpurea and Lantana camara leaves ranged from 10.67 mm to 15.57 mm， which were moderately sensitive， and their antibacterial rates were 58.33% and 60.37%， respectively. The antibacterial effect of the extract from Mangifera indica leaves was the lowest.

Key words： Botanical bactericide； Ralstonia solanacearum； Crude extract； Antibacterial activity； Inhibition zone

青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum是一種毀滅性土傳病害的病原菌，可危害44個科的300多種植物，包括常見的經濟作物和林業植物，如番茄、馬鈴薯、煙草、桑樹、桉樹和木麻黃等[1]，且不斷發現新寄主[2]。

青枯雷爾氏菌生活史包含腐生和寄生，侵染途徑多樣，當遇到合適的寄主，從根部傷口或者次生根的根冠部入侵，并經過木質部，進入到維管束組織，從而系統為害植物，在無寄主的情況下，可以長期存活在土壤、雜草和其他非寄主植物[3]。因此，由青枯雷爾氏菌引起的植物青枯病防治困難，常見的番茄青枯病嚴重制約番茄產業的發展。目前對該病原菌的防治主要采用農藥灌根處理，但長期使用易造成農藥殘留。植物源殺菌劑具有高效、低毒，環境兼容性好等優點，成為農藥研發的熱門領域之一。據報道植物中含有抑菌活性次生代謝物質約40萬種，常見有植物性揮發性油、酚類化合物、生物堿、多糖類化合物等[4]。比如橙皮素對煙草青枯病的防效達51.74%[5]，黃腐酸能提升煙草對青枯病的抗性[6]，順-冷杉醇可作為誘抗劑有效防控煙草青枯病的發生[7]。因此，本試驗采集羊蹄甲Bauhinia purpurea、三裂蟛蜞菊Wedelia chinensis、馬櫻丹Lantana camara Linn.和芒果Mangifera indica L.等4種植物進行提取，測定其提取液對青枯菌的抑制效果，為未來開發植物源殺菌劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試植物及試劑儀器

供試植物材料均取自集美大學周邊（表1）。青枯雷爾氏菌R.solanacearum菌株FJAT-91由福建省農業科學院提供。主要試劑包括95%乙醇（分析純）（西隴科學股份有限公司生產）、氯化鈉（西隴科學股份有限公司生產）、LB肉湯、LB營養瓊脂（青島高科技工業園海博生物技術有限公司生產）；儀器主要為MK3酶標儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產］；R-215旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI公司生產）。

1.2 植物提取液制備

將采集的植物組織洗凈晾干，放入60℃烘干箱干燥24 h，直至水分烘干，粉碎成粉末備用。分別將植物粉末與95%分析純乙醇按1∶10比例浸泡，于20℃、150 r·min-1條件下振蕩浸提72 h，用4層紗布過濾，將濾液放入旋轉蒸發儀濃縮至膏狀物，分別取4 g膏狀物溶于10 mL的50%乙醇稀釋為0.40 g·mL-1的母液，將母液分別稀釋為濃度0.40、0.20、0.10和0.05 g·mL-1，放入冰箱中保存備用。

1.3 青枯雷爾氏菌懸液的制備

將供試菌于LB培養基37℃培養24 h后，取其單菌落1環接種于LB肉湯，37℃恒溫搖床培養24 h后，取4 mL的肉湯置入5 mL離心管中，10000 r·min-1離心5 min，去掉上清液，加入同體積的無菌生理鹽水稀釋混勻后測定吸光度，根據預試驗測定酶標儀OD值和菌液關系，直至波長為600 nm時OD值為0.25，此時菌懸液約為108 cfu·mL-1，再用無菌生理鹽水將菌液調至約為106 cfu·mL-1，4℃保存待用[5]。

1.4 抑菌圈大小測定

培養皿中倒入LB營養瓊脂約20 mL，在培養皿底部用記號筆劃出5個區域做好記號。吸取0.1 mL菌液置于平板中，進行涂布；每個區域放置1個牛津杯（內徑5 mm，高10 mm），輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，其中4個牛津杯中分別注入約0.1 mL濃度為0.05、0.10、0.20、0.40 g·mL-1的植物提取液，剩余1個牛津杯中注入約0.1 mL50%乙醇作為空白對照組，每種濃度重復3次，平板在4℃條件下的冰箱里放置3 h后置于36℃恒溫培養箱中培養24 h，如果有抑菌圈的形成就表示有抑菌效果，測定其抑菌圈直徑大小[8-9]。

參照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》判斷對藥物的敏感性，抑菌圈試驗的判定標準為：抑菌圈直徑＞20 mm為極敏感，15～20 mm為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，5～10 mm為低度敏感，無抑制作用者（≤5 mm）為不敏感[9]。

1.5 最小抑菌濃度（MIC）測定

采用試管2倍稀釋法測定MIC[8-9]，取10支滅菌的2 mL試管，2～9管分別加入對應的液體培養基0.50 mL，第1管中加入0.50 mL的1 g·mL-1植物提取液，第2管中加入0.50 mL的1g·mL-1植物提取液混勻后吸取0.50 mL加入第3管中，依次類推，直至第8管，第8管吸取0.50 mL棄去，使其成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等濃度梯度。向1～8管中分別加入0.50 mL菌液，第9管不加植物提取液，加菌液0.50 mL作為對照，以觀察細菌的生長情況。第10管加植物提取液0.50 mL，混勻后，不加菌液，以觀察提取液是否被污染。重復3次，將各管置于37℃恒溫培養24 h，觀察結果。若藥液透明，可直接判定該濃度為最小抑菌濃度，若色澤較深，則用接種環挑取1環培養液于相應固體培養基上劃線培養24 h，觀察結果，以無菌生長的最低稀釋度為MIC。

1.6 抑菌率的測定

配制含植物提取液的固體培養基：將配制好的每個培養基平板劃分成3個區，每區放置4個牛津杯，每個牛津杯中加入100 uL植物提取液（每種植物有4個濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.40 g·mL-1），室溫放置3 h后去掉牛津杯，待植物提取液完全滲透。然后用滅菌的小鋼管打菌餅 （直徑為5 mm），將菌餅接種到含植物提取液的固體培養基中，每皿3塊，將有菌落的一面朝下放置，對照是將菌餅接種于含有50%乙醇的培養基中。接種好的培養皿置于恒溫培養箱內37℃培養，24 h后用十字交叉法測量菌餅的直徑。并用下述公式計算抑菌率[10-11]。

1.7 數據分析

試驗數據利用EXCEL2007軟件進行數據統計，抑菌圈直徑和抑菌率均采用平均值+標準差的方式，采用SPSS 22.0軟件分別對數據進行Duncan新復極差法單因素方差分析（ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 植物葉提取液對青枯雷爾氏菌抑菌圈的作用

由表2可知，抑菌圈結果顯示青枯雷爾氏菌對三裂蟛蜞菊葉提取液表現為高度敏感，抑菌圈直徑范圍為15.00～18.13 mm，三裂蟛蜞菊葉提取液濃度0.40 g·mL-1時，可以達到18.13 mm，顯著高于其他處理。青枯雷爾氏菌對羊蹄甲葉提取液表現為中度敏感，抑菌圈直徑范圍為11.20～15.00 mm，羊蹄甲葉提取液濃度0.40 g·mL-1時與三裂蟛蜞菊葉提取液濃度0.05 g·mL-1時效果差異不顯著。青枯雷爾氏菌對馬纓丹葉提取液表現為低濃度低度敏感、高濃度中度敏感，抑菌圈直徑范圍為10.67～15.57 mm，馬纓丹葉提取液濃度0.40 g·mL-1時與羊蹄甲葉提取液濃度0.40 g·mL-1、 三裂蟛蜞菊葉提取液濃度0.05 g·mL-1時效果差異不顯著；青枯雷爾氏菌對芒果葉提取液表現為低中度敏感，抑菌圈直徑范圍為9.00～12.67 mm，芒果葉提取液濃度0.40 g·mL-1時抑菌圈直徑最大，與羊蹄甲和馬纓丹葉提取液濃度0.1 g·mL-1差異不顯著。

2.2 植物葉提取液對青枯雷爾氏菌抑菌率的影響

由表2可知，抑菌率最高為三裂蟛蜞菊葉提取液，顯著高于其他3種植物，隨著濃度的升高抑菌率升高，最低為49.81%，最高可達到79.63%；羊蹄甲葉提取液抑制率最高為58.33%；馬纓丹葉提取液高濃度與低濃度提取率差異顯著，最低為21.85%、最高60.37%；芒果葉提取液的抑菌效果較差，濃度0.05 g·mL-1時為16.67%，顯著低于其他處理組，在濃度0.40 g·mL-1時抑制率47.22%，與馬纓丹葉提取液濃度0.20 g·mL-1時無顯著差異。

2.3 最低抑菌濃度的測定結果

由表3可知，羊蹄甲、三裂蟛蜞菊、芒果葉提取液對青枯雷爾氏菌的最小抑菌濃度（MIC）為12.50 mg·mL-1；馬纓丹提取液對青枯雷爾氏菌的MIC為6.25 mg·mL-1。

3 討論與結論

三裂蟛蜞菊葉提取液對青枯菌的抑制效果顯著高于其他3種植物，類似的研究發現，蟛蜞菊葉提取液對黃瓜枯萎病病菌、黃瓜灰霉病病菌和番茄早疫病病菌均有抑制作用[12]。蟛蜞菊的揮發油具有抗菌作用[13]，分離后的成分主要為萜類，生物測定顯示生物堿、萜類、黃酮、酚、醇和酯都具有抑菌活性[12]，比如可抑制芒果炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz和蒂腐菌Botryodiplodia theobromae Pat菌絲生長[14]，對枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、葡萄球菌Staphylococcus aureus、沙門氏菌Salmonella和鰻弧菌Vibrio anguillarum等細菌繁殖均有抑制效果[15]。

很多研究報道羊蹄甲的莖皮、葉、種子均有抑菌活性，包括枯草芽孢桿菌B.subtilis、金黃色葡萄球菌S.aureus、大腸桿菌Escherichia coli、番茄青枯菌Ｒalstonia solanacearum、柑橘潰瘍病菌Xanthomonas citri subsp.citri和煙草野火病菌Pseudomonas syringae pv.tobaci等[16-17]。比如羊蹄甲分離出的抗微生物蛋白對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的最低抑制濃度分別為13、15 mg·mL-1[18]；羊蹄甲水提物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度均≤1500 mg·L-1[19-20]。本試驗中羊蹄甲葉提取物（乙醇）對青枯雷爾氏菌的最小抑菌濃度為12.50 mg·mL-1，明顯高于水提物濃度，濃度0.4 g·mL-1時的抑制率為58.33%。戶勛等[17]報道羊蹄甲種子對番茄青枯菌的抑菌圈直徑約為16 mm，與本試驗的抑菌圈15 mm較為接近。很多研究認為羊蹄甲中的活性物質以黃酮類化合物為主。

馬纓丹入侵很多國家，原產于美洲熱帶地區，現廣泛分布在世界熱帶和亞熱帶地區[21]，被稱為世界十大惡性雜草之一[22]，被我國列為第二批外來物種名單，編入“極高風險的外來入侵植物”名錄[23-25]，因此如果能對馬纓丹進行合理利用，變廢為寶，開發其潛在的應用價值可謂是一舉兩得。馬纓丹葉片揮發油中含有48種化學成分，占揮發油總量的80.66%，其中含量較高的為α-葎草烯（15.22%） 、石竹烯（ 15.07%） 、β-蓽秤茄萜（8.73%）[26]，此外還分離出五環三萜化合物共40 多種[27-28]。有文獻記錄馬纓丹提取液對枯草芽孢桿菌B.subtilis、金黃色葡萄球菌S.aureus、大腸桿菌Escherichia coli等3 種細菌均有不同程度的抑制作用[8]。本試驗中馬纓丹對青枯雷爾氏菌的抑菌率可以達到60%以上。

芒果葉提取液在本試驗中對青枯菌的抑菌活性較差，濃度0.4 g·mL-1時抑菌率最高，為49.22%， 與其他研究比較，芒果葉提取物5 mg·mL-1對水稻紋枯病Rhizoctoniasolani Kühn、芒果炭疽病C.gloeosporioides Penz和芒果蒂腐病B.theobromae Pat抑菌率抑菌活性達到60%以上[29]，顯然在濃度更低的情況下還取得較好的抑菌效果，效果優于本試驗濃度，這可能是由于提取方法不同，對不同菌效果也有所差異。

植物活性的抑菌機理主要通過干擾破壞細胞壁、細胞膜結構和酶系統來抑制微生物生長繁殖，促進細胞膨脹、瓦解細胞原生質和線粒體，抑制孢子萌發、菌絲生長、附著胞和各種子實體的形成等來抑制微生物活性[15]。本試驗通過比較不同植物提取物對青枯雷爾氏菌的抑菌效果，三裂蟛蜞菊在本試驗中表現出良好的抑菌效果，但其主要抑菌活性物質還需要進一步分離鑒定。乙醇作為抑菌成分的提取溶劑，需要進一步進行條件優化，尋找合適高效的提取濃度，為篩選出高效低毒生態安全的植物源抑菌劑提供理論基礎。

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