小白菜根際高效解磷菌的分離鑒定與培養條件優化

王明元，1980年生，博士，華僑大學副教授、碩士生導師，福建省現代農業（水果）產業體系專家，國家良種（香蕉）重大科研聯合攻關團隊專家，主要從事植物微生物共生、香蕉枯萎病生物防治、植物營養生理研究。主持國家自然科學基金、福建省自然科學基金等項目15項；榮獲泉州市科技進步獎2項（三等獎排名第2；二等獎，排名第7）；申請國家發明專利10項，其中已授權6項；在《Scientia Horticulturae》《園藝學報》《微生物學報》等學術刊物發表論文70多篇；指導學生榮獲第七屆中國國際“互聯網+”大學生創新創業大賽銅獎、第五屆福建省“互聯網+”大學生創新創業大賽銅獎等。兼任福建省園藝學會第十三屆理事、福建省泉州市園藝學會副理事長，以及《園藝學報》《植物生理學報》《Scientia Horticulturae》、《Botanical Studies》等期刊審稿人。

摘 要：為評價小白菜Brassica chinensis L.根際微生物分解有機磷的能力，明確其優勢解磷菌的分類學地位，進一步優化培養條件，為開發微生物肥料提供基礎。采用蒙金娜有機磷平板法篩選小白菜根際有機磷分解菌，利用鉬銻抗比色法分析菌株解磷能力；進一步觀察優勢解磷菌的菌落形態，并通過16S DNA序列同源性比對和鄰近法構建系統發育樹，確定優勢菌株FG5的分類學地位；最后，采用單因素和正交試驗進一步探討菌株FG5的最適培養條件。結果表明：小白菜根際共分離篩選出解有機磷菌3株，其中菌株FG5解磷效果最佳，接種菌株FG5培養3 d后，培養基中游離磷質量濃度高達165.20 ug·mL-1。FG5菌落圓形，表面干燥，微微隆起，邊緣波狀的米白色，16S DNA序列同源性比對結果表明其為特基拉芽孢桿菌。單因素和正交試驗優化結果顯示菌株FG5最佳培養條件為：甘露醇為碳源，尿素為氮源，培養溫度27℃，轉速180 r·min-1，接種量1.5 %（V/V）。在該條件下FG5的解磷量達到307.25 ug·mL-1，相較于培養條件優化前，解磷能力提高85.99%。菌株FG5有機磷分解能力強，具有良好的微生物肥料應用潛力。

關鍵詞：小白菜；有機磷分解菌；分離篩選；生物學鑒定；培養條件優化

中圖分類號：S 634.3 ""文獻標志碼：A ""文章編號：0253-2301（2024）01-0001-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.01.001

Isolation and Identification of the High Efficient Phosphate-solubilizing Bacteria from theRhizosphere of Brassica chinensis L. and the Optimization of Culture Conditions

Abstract： In order to evaluate the ability of microorganism in the rhizosphere of Brassica chinensis L. to decompose the organic phosphorus， the taxonomic status of its dominant phosphate-solubilizing bacteria was clarified， and the culture conditions were further optimized， thus to provide the basis for the development of microbial fertilizers. The organic phosphorus-decomposing bacteria in the rhizosphere of Brassica chinensis L. were screened by using the Mengjinna organic phosphorus plate method， and the phosphate-solubilizing ability of the strains was analyzed through the molybdenum antimony resistance colorimetric method. Then， the colonial morphology of the dominant phosphate-solubilizing bacteria was further observed. And the phylogenetic tree was constructed through the homology comparison of 16S DNA sequence and nearest neighbor method to determine the taxonomic status of the dominant strain FG5. Last， the optimum culture conditions of strain FG5 were further explored by using the single factor and orthogonal experiments. The results showed that： three strains of organic phosphate-solubilizing bacteria were isolated and screened from the rhizosphere of Brassica chinensis L.， among which the strain FG5 had the best phosphate-solubilizing effect. After the inoculation with strain FG5 and culture for 3 days， the mass concentration of free phosphorus in the medium was as high as 165.20 ug·mL-1. The colony of FG5 was circular with a dry surface and slight protrusions， and the edges were wavy off white. The homology comparison results of the 16S DNA sequence indicated that the strain FG5 was Bacillus tequilensis. The results of single factor and orthogonal experiments showed that the optimum culture conditions for the strain FG5 were as follows： mannitol as carbon source， urea as nitrogen source， culture temperature of 27℃， rotational speed of 180 r·min-1， inoculation amount of 1.5% （V/V）. Under this condition， the phosphate-solubilizing ability of FG5 reached 307.25 ug·mL-1， which was 85.99% higher than that before the optimization of culture conditions. The strain FG5 had a strong ability to decompose the organic phosphorus and had good potential for the application of microbial fertilizers.

Key words： Brassica chinensis L.； Organophosphorus-solubilizing bacteria； Separation and screening； Biological identification； Optimization of culture conditions

小白菜Brassica chinensis L.，十字花科蕓薹屬草本植物，富含蛋白質、維生素C、粗纖維及多種微量元素，是我國百姓餐桌上主要蔬菜之一。而磷元素是影響小白菜生長發育的關鍵因子[1]。在我國整體推進肥料減量化以及有機（生物）肥替代化肥的背景下，土壤中豐富的有機磷如何高效轉化為植物可以直接吸收的磷形態至關重要。研究表明，根際土壤微生物在有機磷礦化過程具有重要貢獻[2-3]。王夢姣等[4]從藍莓根際中篩選出的優勢有機磷分解菌L42，解磷量僅有4.99 mg·L-1。鄧征等[5]發現辣木根際解磷菌M8，解磷量為 26.95 mg·L-1。李靜[6]研究表明荒漠鹽生植物根際微生物MHCB30，解磷量為 30.33 mg·L-1。研究人員在持續關注土壤中解磷菌株的分離篩選，然而大多數已有報道的解磷菌株對有機磷的分解能力不突出。同時，已有研究對菌株的生長特性探討的亦較少。基于此，本研究以小白菜根際土壤為研究材料，通過微生物菌株的分離篩選試驗，期望獲得小白菜根際高效解磷菌株，并對菌株生長條件進行優化，為后續解磷菌株在微生物肥料中的產業化應用提供數據支撐。本試驗的實施，有望獲得更多高效解磷菌株；同時，明確高效解磷菌株培養的碳源、氮源、培養溫度、接種量等生長條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品采集 2023年5月，土壤樣品取自廈門市翔安區新圩鎮某蔬菜園，種植土壤為紅壤。該菜園全年生產小白菜品種小白苗，生長期為1個月。隨機從蔬菜園取新鮮小白菜10株，連根拔起，將根系上的土輕輕抖下來，收集，裝在滅菌后的封口袋內，帶回實驗室，放入4℃冰箱中保存備用。

1.1.2 主要試劑 （1）蒙金娜有機磷培養基：葡萄糖10 g、硫酸銨0.5 g、氯化鈉0.3 g、硫酸鎂0.3 g、硫酸錳 0.03 g、氯化鉀0.3 g、硫酸亞鐵0.03 g、蛋黃卵磷脂2.0 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.0±0.2（固體添加1.5%瓊脂）。（2）LB培養基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，pH 7.4（固體添加1.5%瓊脂）。（3）PDA培養基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、蒸餾水1000 mL。馬鈴薯洗凈去皮，切塊后煮沸30 min，加入葡萄糖，攪拌溶解，稍冷卻后加蒸餾水補齊至1000 mL（固體添加1.5%瓊脂）。（4）改良高氏1號培養基：可溶性淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO3 1 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.4～7.6（固體添加1.5%瓊脂）。（5）鉬銻儲存液：鉬酸銨10 g、酒石酸銻鉀0.5 g、濃硫酸126 mL，定容至1 L。（6）磷工作溶液：稱取1.5 g抗壞血酸溶解于100 mL鉬銻儲存液中。（7）磷標準液（1 mg·mL-1）：磷酸二氫銨3.85 g、500 mL提取劑，定容至1 L。（8）2，4-二硝基酚指示劑。（9）6 mol·L-1氫氧化鈉溶液：氫氧化鈉24 g，定容至100 mL。（10）2 mol·L-1硫酸溶液：量取98%濃硫酸108.7 mL，定容至1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 根際微生物分離純化與解磷菌篩選 稱取10 g土樣，用無菌水依次稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8土壤稀釋液。取10-4～10-2稀釋度的土壤浸出液涂布于PDA培養基中， 10-5～10-3稀釋度的土壤浸出液涂布到改良高氏1號培養基中，10-8～10-6稀釋度的土壤浸出液涂布到LB培養基中[7]。于30℃恒溫培養箱內倒扣培養24 h。培養結束后，挑選不同單菌落進行編號，分別分離純化，并接種于蒙金娜有機磷培養基中，于37℃恒溫培養箱內倒扣培養3 d。

1.2.2 磷標準曲線繪制 將磷標準液依次稀釋至10、20、30、50、70、90、100 ug·mL-1，在700 nm分光光度計下采用鉬藍分光光度法[9]測定其吸光度，以吸光度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.3 解磷能力定量測定 將上述篩選得到具有解磷能力的菌株提前活化12 h，接種于蒙金娜有機磷培養基中，在30℃、200 r·min-1搖床上培養3 d，空白培養基為對照。培養結束后，用移液槍取2 mL菌液，在10000 r·min-1條件下離心6 min，取上清液1.8 mL，定容至50 mL，700 nm分光光度計下測定吸光度，利用磷標準曲線計算解磷量。

1.2.4 菌株系統發育樹構建 篩選獲得最優解磷菌株。將純化的菌液保存在離心管中，送往北京擎科生物科技有限公司，采用細菌通用引物[8]27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTACGACTT-3′）測序。測序結果在NCBI網站進行BLAST同源性比對，選擇同源性相近菌株，使用MEGA11.0鄰近法構建系統發育樹。

1.2.5 解磷菌株培養條件優化 （1）單因素試驗。碳源：基于蒙金娜有機磷培養基配方，分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇為唯一碳源；氮源：基于蒙金娜有機磷培養基配方，分別以蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨、氯化銨、尿素為唯一氮源；培養溫度：分別為24、27、30、33、36、39℃，以甘露醇和尿素為碳氮源；培養轉速：分別為120、140、160、180、200、220 r·min-1，培養溫度30℃，以甘露醇和尿素為碳氮源；接種量：分別為0.25%、0.5%、1.5%、2%、3%、4%（V/V），培養溫度30℃、轉速200 r·min-1，以甘露醇和尿素為碳氮源。每個處理設置3個重復，上述培養時間均為72 h。（2）正交試驗。針對單因子培養條件優化結果，選取溫度（A）、轉速（B）、接種量（C）為影響因素，每個因素設置3個水平，安排三因素三水平的正交試驗L9（33），進一步探索菌株分解有機磷最適培養條件，每組試驗處理設置3個重復，培養時間為72 h。

1.3 數據統計分析

采用SPSS Statistics 26軟件進行數據的差異顯著性分析（Plt;0.05），使用Excel 2003作圖。

2 結果與分析

2.1 小白菜根際土壤解磷菌株分離

本試驗從小白菜根際土壤中共分離出17個菌株，其中從PDA培養基中分離的有FG1、FG2、FG3、FG4、FG5；從改良高氏1號培養基中分離的有AC1、AC2、AC3、AC4、AC5、AC6；從LB培養基中分離的有BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6。然而，在蒙金娜有機磷培養基上生長的菌株只有3株，分別為AC3、BC3和FG5（圖1），初步判斷以上3個菌株具備解磷能力。FG5菌落為米白色，正反面顏色一致，無水溶性色素。菌落表面呈現圓形，微微隆起，邊緣呈波狀，干燥。

2.2 小白菜根際土壤高效解磷菌菌株篩選

試驗得到磷標準曲線方程為y=49.75324x-1.71477，R2=0.99718。由圖2可知，在蒙金娜有機磷培養基中培養3 d后，接種FG5菌株的培養基中游離磷含量達到165.20 ug·mL-1，顯著高于菌株AC3和BC4。

2.3 解磷菌株FG5分子鑒定

將菌株FG5序列提交至GenBank獲得登錄號MW009674.1。BLAST同源性比對結果顯示，菌株FG5與多株芽孢桿菌的相似度達到99%以上，初步認為菌株FG5為Bacillus屬細菌。選取同源性相似菌株，用鄰近法在MEGA 11.0軟件上構建菌株FG5的系統發育樹（圖3）。結果表明，FG5與Bacillus tequilensis的親緣關系最近，支持率達到95%。

2.4 菌株FG5的單因子培養條件優化

2.4.1 碳氮源供應狀況 由圖4a可知，解磷菌株FG5能夠利用4種碳源，且在不同碳源培養下的解磷能力依次為甘露醇gt;蔗糖gt;葡萄糖gt;可溶性淀粉。但不同碳源培養下，菌株FG5分解有機磷能力差異顯著。其中，當碳源為甘露醇時，菌株FG5分解有機磷能力最強，解磷質量濃度高達268.39 ug·mL-1，顯著高于其他3個碳源（Plt;0.05）。在4種碳源中，菌株FG5利用可溶性淀粉分解有機磷的能力最弱，僅為86.42 ug·mL-1。

由圖4b可知，菌株FG5可以利用5種氮源分解有機磷，且在不同氮源培養下的解磷能力依次為尿素gt;硫酸銨gt;酵母浸粉gt;蛋白胨gt;氯化銨。其中，氮源為尿素時菌株FG5分解有機磷能力最強，解磷質量濃度達到257.87 ug·mL-1，顯著高于其他氮源（Plt;0.05）。

2.4.2 培養溫度和轉速 由圖5a可知，菌株FG5在24～39℃范圍均具有解磷能力，且不同溫度下解磷能力有差別，但差異不明顯。在培養溫度24～30℃，菌株FG5解磷能力隨著培養溫度的升高而升高，至30℃解磷能力最高，達到290.39 ug·mL-1。在溫度高于30℃下，菌株FG5的解磷能力下降。

由圖5b可知，菌株FG5在轉速120～220 r·min-1范圍內，不同轉速下菌株FG5解磷能力有差別。至200 r·min-1時解磷能力達到最高，達到290.39 ug·mL-1。在轉速高于200 r·min-1下，菌株FG5的解磷能力下降。

2.4.3 接種量 由圖6可知，菌株FG5接種量對解磷能力有明顯影響。在接種量0.25%（V/V）時，菌株FG5的解磷濃度最小，為249.02 ug·mL-1，在接種量1.5%（V/V）時達到最大，解磷質量濃度為301.26 ug·mL-1。

2.5 菌株FG5的正交培養條件優化

由表2可知，表明溫度、轉速、接種量這3個因素對FG5菌株分解有機磷的影響順序為Agt;Bgt;C，分解有機磷效果最佳水平方案為A1B1C2，即培養條件為溫度27℃、轉速180 r·min-1、接種量1.5%（V/V）。基于A1B1C2水平試驗方案，重新進行菌株FG5的有機磷分解能力試驗。在該條件下得到FG5最佳有機磷分解能力為307.25 ug·mL-1，相較于培養條件優化前165.20 ug·mL-1的解磷量，提高了85.99%。

3 結論與討論

自然界中，土壤有機化合物礦化后轉為可溶性化合物過程，微生物是主要貢獻者，從而為植物對礦質元素的吸收提供了先決條件[10-11]。本研究從小白菜根際土壤中分離獲得FG5菌株，經鑒定為特基拉芽孢桿菌Bacillustequilensis。研究表明，特基拉芽孢桿菌對甘薯長喙殼菌[12]、油茶炭疽菌[13]、稻瘟病菌[14]等具有顯著的生防作用。另有研究發現特基拉芽孢桿菌能夠促進植物生長[15-16]，增加難溶性鋅溶解性[17]。然而，特基拉芽孢桿菌對有機磷的分解研究少有報道，本研究首次發現FG5菌株能夠高效分解土壤中有機磷，為特基拉芽孢桿菌在微生物肥料上的應用提供了重要支撐。

本研究對解磷菌株FG5的培養條件進行了優化。培養基中碳氮源的選擇，極大程度上影響菌株對有機磷的分解能力[18]。試驗發現利用甘露醇為碳源和尿素為氮源時，FG5菌株解磷能力最強。唐岷宸等[19]發現以甘露醇為唯一碳源時溶磷能力最強；劉治會等[20]和李統華[21]同樣發現以尿素作為氮源的效果最佳，與本試驗結果一致。單因子試驗中，菌株FG5的最適培養轉速為200 r·min-1。梁曉輝等[22]提出提高轉速能提高培養基中溶氧水平，但轉速過高容易造成細胞的機械損傷。接種量對于解磷菌解磷性能的影響較小。接種量達到一定數值后，繼續增加接種量，對菌株生長量的增加不明顯。于淼等[23]在接種量達到1%（V/V）后，解磷量就沒有明顯區別，進一步印證上述結果。

本研究從小白菜根際土壤中分離篩選出有機磷高效分解菌株FG5，FG5在蒙金娜有機磷培養基中培養3 d，培養基中游離磷質量濃度高達165.20 ug·mL-1。經16S DNA序列同源性比為初步鑒定FG5為特基拉芽孢桿菌。單因素和正交試驗優化結果顯示菌株FG5最佳培養條件為：甘露醇為碳源、尿素為氮源，培養溫度27℃，轉速180 r·min-1，接種量1.5%（V/V）。在該條件下FG5的解磷質量濃度達到307.25 ug·mL-1，相較于培養條件優化前，解磷能力提高85.99%。綜上所述，菌株FG5具有強大的解磷能力，為小白菜微生物肥料的開發提供了技術支撐。

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