梔子苷調(diào)節(jié)HMGB1-RAGE信號通路對子癇前期大鼠血管內(nèi)皮細胞損傷的影響*

楊厚君,程 佳,張水勤

宜賓市第二人民醫(yī)院產(chǎn)科,四川宜賓 644000

子癇前期是一種發(fā)源于女性妊娠期間的孕期疾病,該癥狀一般出現(xiàn)在妊娠20周之后[1],一般表現(xiàn)為高血壓、尿蛋白,還會出現(xiàn)全身或局部腫脹,病情嚴重時還會引起孕婦和胎兒一些并發(fā)癥,產(chǎn)后還有可能會引發(fā)卒中[2]。有研究表明,炎癥和氧化應(yīng)激是子癇前期從基本的病理改變發(fā)展到器官損害的重要環(huán)節(jié),子癇前期胎盤局部氧化應(yīng)激水平顯著升高,且胎盤氧化應(yīng)激可導(dǎo)致促炎細胞因子產(chǎn)生增加,進而導(dǎo)致胎盤功能障礙[3-4]。目前針對子癇前期尚無有效的預(yù)防措施和治療方法,因此研發(fā)新的藥物具有重要意義。梔子苷是從茜草科植物梔子果實中提取的一類環(huán)烯醚萜苷類化合物,具有抗炎、抗氧化、降血糖、抗動脈粥樣硬化等作用[5]。據(jù)報道,梔子苷具有降低氧化應(yīng)激和降血壓的作用,可抑制子癇前期大鼠胎盤組織氧化應(yīng)激和炎癥損傷[6]。但其作用機制尚不完全明確。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種普遍存在的核蛋白,在缺氧細胞應(yīng)激或壞死的情況下,HMGB1被釋放到細胞外環(huán)境中,由于各種細胞膜受體的參與,細胞外HMGB1具有促炎作用,特別是晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE),HMGB1分泌到細胞外與其受體RAGE結(jié)合,進一步活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB),激活該信號通路,促進炎癥因子的分泌釋放。有研究表明,HMGB1和RAGE在子癇前期患者血清和胎盤中呈高表達,且與疾病嚴重程度呈正相關(guān)[7]。梔子苷可以顯著降低HMGB1水平[8]。因此,本研究就梔子苷調(diào)節(jié)HMGB1-RAGE信號通路對子癇前期大鼠血管內(nèi)皮細胞損傷的影響進行探討,以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取200～220 g發(fā)情期SD雌性大鼠50只,雄性大鼠25只,均購自四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場[合格證號:SCXK(川)2021-037],適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,自由取食和飲水,環(huán)境溫度為(22±2)℃,相對濕度為60%±5%,光照為12 h光-暗循環(huán)。

1.2實驗試劑 梔子苷購自優(yōu)利科生命科學(xué)有限公司;HMGB1抑制劑丙酮酸乙酯(EP)購自上海古朵生物科技有限公司;一氧化氮合酶抑制劑L-NAME購自南京賽泓瑞生物科技有限公司;白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司;BCA試劑盒購自上海晶風(fēng)生物科技有限公司;HMGB1、RAGE、NF-κB、p-NF-κB、淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)一抗及二抗均購自英國Abcam公司。XR900大鼠尾動脈無創(chuàng)血壓儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)。

1.3分組與造模 將發(fā)情期SD大鼠分別于傍晚6時按照雌雄比例2∶1合籠配對,于次日早晨采集陰道分泌物涂片鏡檢,鏡下見精子即認定已受孕,記為第1天。將受孕后大鼠隨機分為對照組(n=10)和造模組(n=40),造模組大鼠從妊娠第7天開始皮下注射L-NAME 100 mg/(kg·d)構(gòu)建子癇前期大鼠模型,對照組注射等體積生理鹽水,1次/天,至妊娠第13天。造模組大鼠第14天收縮壓上升均大于30 mmHg,且收縮壓大于115 mmHg,提示造模成功[9]。

將造模成功的大鼠隨機分為模型組、梔子苷低劑量組、梔子苷高劑量組、EP組,每組10只。于大鼠妊娠第14天開始給藥,梔子苷低、高劑量組分別給予梔子苷25 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)灌胃[10]并腹腔注射等體積格林溶液,EP組腹腔注射EP格林溶液[40 mg/(kg·d)][11]并灌胃等體積生理鹽水,對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水并腹腔注射等體積格林溶液,每天1次,至妊娠第19天。

1.4血壓測定 所有大鼠于妊娠第14、17、19天采用大鼠尾動脈無創(chuàng)血壓儀測量尾動脈收縮壓。測量前先將孕鼠置于預(yù)熱箱內(nèi)(預(yù)熱至36 ℃),待其安靜后測量。每只大鼠測量3次,取平均值。

1.524 h尿蛋白檢測 用標準代謝籠收集大鼠第14、17、19天的24 h尿液,按照蛋白試劑盒(考馬斯亮藍染色)檢測說明書檢測尿液中的24 h蛋白水平。

1.6IL-1β、IL-6和TNF-α水平測定 采集大鼠主動脈血液,3 500 r/min離心10 min收集上清,嚴格按照試劑盒說明操作步驟檢測IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.7SOD、GSH、MDA水平檢測 處死大鼠后收集胎盤組織樣本,取部分胎盤組織冰浴研磨勻漿,然后按照試劑盒說明操作步驟檢測SOD、CAT、MDA水平。

1.8HE染色觀察胎盤組織形態(tài)變化 取1.7中新鮮胎盤組織固定后石蠟包埋切片,HE染色,觀察胎盤組織形態(tài)變化情況。

1.9Western blot檢測胎盤組織HMGB1、RAGE、NF-κB、p-NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白水平 取1.7中胎盤組織勻漿,提取總蛋白質(zhì),BCA法檢測組織中蛋白表達水平,蛋白變性后進行電泳然后轉(zhuǎn)膜,封閉液中封閉后加入HMGB1、RAGE、NF-κB、p-NF-κB、Bcl-2、Bax(稀釋1∶1 500)一抗4 ℃搖床過夜,清洗后再分別添加相應(yīng)二抗(稀釋1∶5 000)孵育后,加入ECL顯色,最后用Image-Pro Plus軟件進行蛋白定量分析(β-actin為內(nèi)參)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠收縮壓比較 與對照組相比,模型組大鼠第14、17、19天收縮壓顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比,梔子苷低、高劑量組大鼠在第14天收縮壓比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),在第17、19天大鼠收縮壓顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與梔子苷高劑量組相比,EP組大鼠在第14、17、19天收縮壓比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),梔子苷低劑量組大鼠在第17、19天收縮壓顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠收縮壓比較

2.2各組大鼠24 h尿蛋白比較 與對照組相比,模型組在第14、17、19天24 h尿蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,梔子苷低、高劑量組在第14天24 h尿蛋白水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);第17、19天24 h尿蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與梔子苷高劑量組相比,EP組大鼠在第14、17、19天24 h尿蛋白水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),梔子苷低劑量組大鼠在第17、19天24 h尿蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠尿蛋白比較

2.3各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較 與對照組相比,模型組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,梔子苷低、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與梔子苷高劑量組相比,EP組血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),梔子苷低劑量組血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

2.4各組大鼠胎盤組織SOD、GSH、MDA水平比較 與對照組相比,模型組大鼠胎盤組織中SOD、GSH水平顯著降低,MDA水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,梔子苷低、高劑量組大鼠胎盤組織中SOD、GSH水平顯著升高,MDA水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與梔子苷高劑量組相比,EP組大鼠胎盤組織中SOD、GSH、MDA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),梔子苷低劑量組胎盤組織中SOD、GSH水平顯著降低,MDA水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠胎盤組織中SOD、GSH、MDA水平比較

2.5各組大鼠胎盤組織形態(tài)變化 對照組胎盤結(jié)構(gòu)形態(tài)正常;與對照組相比,模型組大鼠胎盤絨毛顯著減少,可見部分絨毛纖維素樣壞死;梔子苷低、高劑量組和EP組病理形態(tài)改變明顯輕于模型組。見圖1。

圖1 各組大鼠胎盤組織病理學(xué)變化(HE染色,×400)

2.6各組大鼠胎盤組織HMGB1、RAGE、p-NF-κB/NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白水平比較 與對照組相比,模型組大鼠胎盤組織HMGB1、RAGE、p-NF-κB/NF-κB、Bax蛋白水平顯著升高,Bcl-2蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,梔子苷低、高劑量組HMGB1、RAGE、p-NF-κB/NF-κB、Bax蛋白水平顯著降低,Bcl-2蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與梔子苷高劑量組相比,EP組大鼠胎盤組織HMGB1、RAGE、p-NF-κB/NF-κB、Bax、Bcl-2蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),梔子苷低劑量組胎盤組織HMGB1、RAGE、p-NF-κB/NF-κB、Bax蛋白水平顯著升高,Bcl-2蛋白水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5、圖2。

注:A為對照組;B為模型組;C為梔子苷低劑量組;D為梔子苷高劑量組;E為EP組。

表5 各組大鼠胎盤組織HMGB1、RAGE、p-NF-κB/NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白水平比較

3 討 論

子癇前期是孕婦妊娠期20周以后出現(xiàn)的一種特有疾病,臨床表現(xiàn)為高血壓、尿蛋白[12]。有研究表明,子癇前期患者還會伴隨出現(xiàn)血管功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等[13],會對孕婦和胎兒造成嚴重損害,甚至?xí)＜霸袐D和胎兒的生命[14]。目前,子癇前期的發(fā)病機制尚不明確,沒有有效的治療手段。因此探究其發(fā)病機制和探尋新的藥物對治療子癇前期具有重要意義。

梔子苷是中藥梔子發(fā)揮藥效的主要成分,是一種天然的抗氧化劑和抗炎產(chǎn)品,對多種疾病具有生物學(xué)活性[15]。DUSABIMANA等[16]研究發(fā)現(xiàn),梔子苷通過增強自噬并激活A(yù)MPK來減少氧化應(yīng)激對糖尿病引起的腎損傷。TU等[17]研究發(fā)現(xiàn),梔子苷可通過激活糖尿病視網(wǎng)膜病變中的Nrf2信號通路來減輕高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥。此外,梔子苷被報道可降低子癇前期大鼠平均尾動脈壓和24 h尿蛋白水平,抑制胎盤組織氧化應(yīng)激和炎癥損傷[6]。本研究結(jié)果顯示,梔子苷干預(yù)后的第17、19天子癇前期大鼠收縮壓、24 h尿蛋白水平,血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平、胎盤組織MDA水平、Bax蛋白顯著降低,SOD活性、GSH、Bcl-2蛋白水平升高,表明梔子苷可降低炎癥反應(yīng),抑制子癇前期大鼠胎盤組織氧化應(yīng)激損傷;HE染色結(jié)果也表明梔子苷處理可改善子癇前期大鼠胎盤組織病理形態(tài)改變,這與既往的研究結(jié)果一致[6],再次證實了梔子苷對子癇前期大鼠胎盤損傷的改善作用。

HMGB1是一種促炎因子,在內(nèi)皮細胞損傷、組織損傷和細胞死亡過程中均發(fā)揮重要作用[18]。其分泌到細胞質(zhì)和細胞外后與糖基化終產(chǎn)物受體RAGE結(jié)合發(fā)揮促炎作用,通過進一步激活NF-κB,增加炎癥因子的分泌釋放,引起細胞氧化應(yīng)激和炎癥損傷[19]。因此HMGB1-RAGE信號通路在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。WANG等[20]研究表明,抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信號通路可減輕海馬神經(jīng)炎癥從而緩解神經(jīng)認知障礙。ZOU等[21]研究表明,抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信號通路可以改善血栓閉塞性血管炎。據(jù)報道,滋養(yǎng)細胞中HMGB1水平升高可能是子癇前期胎盤釋放的毒性因素之一,可促進子癇前期的發(fā)展[22]。本研究結(jié)果顯示,子癇前期大鼠胎盤組織中HMGB1、RAGE、p-NF-κB/NF-κB蛋白水平顯著升高,表明HMGB1-RAGE通路被激活。梔子苷可降低子癇前期大鼠胎盤組織中HMGB1、RAGE、p-NF-κB/NF-κB蛋白水平;EP是HMGB1-RAGE信號通路抑制劑,經(jīng)EP處理后,大鼠第17、19天收縮壓、24 h尿蛋白水平、血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平、胎盤組織中MDA水平、HMGB1、RAGE、p-NF-κB/NF-κB、Bax蛋白水平均降低,胎盤組織SOD、GSH水平、Bcl-2蛋白水平升高,與梔子苷高劑量處理結(jié)果一致;提示梔子苷可能通過抑制HMGB1-RAGE信號通路改善子癇前期大鼠胎盤損傷。

綜上所述,梔子苷可能通過抑制HMGB1-RAGE信號通路來緩解子癇前期大鼠胎盤損傷。下一步課題組將對HMGB1-RAGE信號通路進行干預(yù),進一步驗證梔子苷的作用機制。此外,中藥成分對機體作用靶點較多,梔子苷能否通過其他途徑發(fā)揮作用還需深入研究。