丙泊酚減弱CCL4誘導腦微血管內皮細胞促炎和細胞毒作用機制研究

趙 娟,龔葛松

南通大學附屬啟東醫院:1.麻醉科;2.神經內科,江蘇南通 226200

腦卒中為常見急性腦血管疾病,致死率高,且近50%生存患者長期致殘,預后差[1-2]。有研究表明,大腦缺血損傷后,中樞系統免疫細胞如巨噬細胞等被大量活化,釋放細胞因子,而這些細胞因子及其招募活化的免疫細胞又可至損傷部位,造成二次損傷[3-5]。近年研究發現,趨化因子配體4(CCL4)在大腦缺血損傷后上調[6-8],其功能可能與破壞血腦屏障、促進T細胞招募至損傷部位有關[9]。有研究顯示,腦微血管內皮細胞在炎癥過程中可通過自分泌形式產生大量CCL4[10],但其作用機制尚不清楚。丙泊酚為臨床手術常用麻醉劑,近年研究發現,丙泊酚除了具有麻醉效果外,還具備抗焦慮、神經保護、抗氧化、免疫調節活性[11-13],在大腦缺血損傷后的抗炎作用也有廣泛報道[14],但丙泊酚對腦微血管內皮細胞保護作用報導較少。

本研究擬將CCL4與永生化人腦微血管內皮細胞hCMEC/D3體外孵育,觀察CCL4對hCMEC/D3細胞增殖及凋亡的影響,同時分析炎癥及促血栓形成相關基因表達情況。本研究將丙泊酚與CCL4聯合處理,分析丙泊酚是否拮抗CCL4對腦微血管內皮細胞作用,以期為丙泊酚作為減少腦卒中患者二次損傷保護劑提供依據。

1 材料與方法

1.1材料來源 hCMEC/D3 人腦微血管內皮細胞購自中國科學院昆明細胞庫。丙泊酚、人重組CCL4細胞因子購自北京科昕生物科技有限公司,凋亡試劑盒購自BD公司,環氧化酶-2(COX-2)活性測定試劑盒和凝血酶活性測定試劑盒購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組 采用hCMEC/D3細胞專用培養基(XY-h070-0016,上海信裕公司)置于37 ℃、5% CO2且濕度飽和的培養箱中培養。細胞分組如下:(1)對照組,采用生理鹽水處理;(2)CCL4組,CCL4處理,質量濃度為500 pg/mL;(3)CCL4+丙泊酚組,CCL4及丙泊酚處理,質量濃度分別為500 pg/mL和10 μg/mL。

1.2.2CCK-8試驗檢測細胞增殖能力 將hCMEC/D3細胞制成單細胞懸液,分別接種于96孔板,每孔1 000個細胞,將接種好的 96孔板放入培養箱中。待24 h細胞貼壁后,對照組、CCL4組和CCL4+丙泊酚組各孔內分別更換為生理鹽水(對照)、含CCL4及含CCL4和丙泊酚的培養液,并于加藥時,以及加藥24、48和72 h將10%的 CCK-8試劑加入待檢測孔中,37 ℃孵育 4 h,每個時間點設置 6個復孔。采用酶標儀檢測各時間點各孔的吸光度(A450)。

1.2.3Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡情況 將對數期生長的hCMEC/D3細胞,按3×105個/孔接種于6孔板中,分3組,每組設置3個復孔,各組分別加入等體積含0、500 pg/mL CCL4、10 μg/mL丙泊酚+500 pg/mL CCL4的培養液。置于培養箱中培養48 h,收集各孔培養液,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,收集所有細胞。各加入5 μL Annexin V和PI避光染色15 min。上機,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,實驗重復3次。

1.2.4實時熒光定量PCR(qPCR) 總RNA提取、逆轉錄及qPCR均按說明書操作。PCR反應條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min,共40 循環。qPCR使用ABI 7500儀器進行。根據待測標本的Ct值,以β-actin作為內參,采用2-ΔΔCt法計算相對表達水平。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.5酶活性檢測 將對數期生長的hCMEC/D3細胞,按3×105個/孔接種于6孔板中,分3組,每組設置3個復孔,各組分別加入等體積生理鹽水或含500 pg/mL CCL4、10 μg/mL丙泊酚+500 pg/mL CCL4的培養液。按照說明書分別使用COX-2活性測定試劑盒和凝血酶活性測定試劑盒檢測各組細胞COX-2活性和凝血酶活性。

2 結 果

2.1丙泊酚對CCL4誘導腦微血管內皮細胞細胞毒作用的影響 CCK-8試驗結果顯示:CCL4組與對照組比較,細胞增殖活力明顯減弱(P<0.01);CCL4+丙泊酚組與CCL4組比較,CCL4+丙泊酚組細胞增殖活力顯著增強(P<0.01);結果提示,丙泊酚對血管內皮細胞有保護作用。與此相符,細胞克隆試驗結果表明,CCL4組細胞克隆形成數量顯著低于對照組(P<0.01),丙泊酚+CCL4組可減弱CCL4對血管內皮細胞克隆形成的抑制作用(P<0.01)。見表2和圖1。

注:A為3組細胞克隆形成試驗結果;B為3組細胞形成克隆數量比較;**P<0.01。

表2 3組細胞增殖能力及克隆形成能力比較

2.2丙泊酚對CCL4誘導血管內皮細胞凋亡作用的影響 流式細胞術檢測結果顯示,CCL4組細胞較對照組細胞凋亡率顯著增加(P<0.01),CCL4+丙泊酚組較CCL4組細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。見圖2。

注:A為3組細胞凋亡流式圖;B為3組細胞凋亡率比較;**P<0.01。

2.3丙泊酚對CCL4誘導血管內皮細胞相關炎癥基因表達的影響 利用qPCR檢測各處理組血管內皮細胞相關炎癥基因的表達,結果發現,CCL4組細胞較對照組表達倍數顯著升高(P<0.01),提示丙泊酚可明顯抑制CCL4對血管內皮細胞炎癥基因表達促進作用。COX-2活性測定結果顯示,CCL4組細胞COX-2活性較對照組明顯升高(P<0.01),提示丙泊酚可明顯抑制CCL4對血管內皮細胞COX-2活性促進作用。見表3。

表3 3組細胞炎癥基因相對表達倍數及COX-2相對活性比較

2.4丙泊酚對CCL4誘導血管內皮細胞細胞血栓形成相關基因的影響 qPCR檢測結果顯示,CCL4組細胞Thrombin、Factor 8、VWF、TXA較對照組基因的表達倍數顯著升高(P<0.01),提示丙泊酚可明顯抑制CCL4對血管內皮細胞血栓形成表達促進作用。凝血酶活性測定結果發現,CCL4組細胞凝血酶活性較對照組明顯升高(P<0.01),而丙泊酚可明顯抑制CCL4對血管內皮細胞凝血酶活性促進作用。見表4。

表4 3組細胞血栓形成相關基因相對表達水平及凝血酶活性比較

3 討 論

CCL4又稱為巨噬細胞炎性蛋白1β(MIP-1β),可選擇性與穿膜受體CCR5結合,在炎癥處招募單核細胞、T細胞等免疫細胞[15-16]。體外實驗表明,CCL4可顯著促進血管內皮細胞ROS形成,促進單核細胞THP-1與內皮細胞結合,從而發揮炎癥效應[17]。然而,關于CCL4對腦微血管內皮細胞的直接作用的報道較少。本研究用重組CCL4因子處理腦微血管內皮細胞,培養24 h即出現增殖活力顯著下降現象,培養72 h后CCL4處理組細胞增殖活力為對照組的60%,表明CCL4對腦微血管內皮細胞增殖有顯著抑制作用。與此相符,本研究還發現,CCL4處理組細胞較對照組細胞的細胞克隆形成能力減弱,并且誘導細胞凋亡率增加,表明CCL4對血管內皮細胞有直接的毒性作用。

腦缺血可促進炎癥環境形成,除巨噬細胞、淋巴細胞外,血管內皮細胞本身在腦部受損后可釋放細胞因子[18-20]。本研究利用qPCR檢測CCL4誘導后內皮細胞釋放細胞因子表達變化,結果發現CCL4誘導后,血管內皮細胞表達相關炎癥因子IL1-β、IL-6、IL-8及TNF-α水平顯著上調,同時炎癥通路核心轉錄因子NF-κB水平上調;COX-2水平及體外酶活性在CCL4刺激下顯著升高,表明CCL4不僅對腦微血管細胞有細胞毒作用,還能激活內皮細胞表達炎癥因子及COX-2,促進受損環境的炎癥反應。除炎癥外,內皮細胞可表達血栓形成相關基因,參與凝血級聯反應,在腦卒中缺血損傷起到重要作用[21]。本研究結果顯示,CCL4可明顯誘導細胞凝血酶活性、Factor 8、VWF及TXA的表達,表明CCCL4可通過刺激腦微血管內皮細胞炎癥反應影響血栓形成。

丙泊酚作為靜脈麻醉劑有諸多優點,如鎮靜、催眠、遺忘效應、作用時間短、起效快、易于控制、清醒時間快、不易引起藥物蓄積等[22-23],因此廣泛用于腫瘤切除手術中。丙泊酚除麻醉效應外,還具有抗炎、神經保護作用,但其藥理機制不明確。本研究發現,丙泊酚可緩解CCL4對腦微血管內皮細胞增殖、克隆形成的抑制,減弱CCL4對內皮細胞凋亡誘導作用。在抗炎方面,丙泊酚可CCL4對內皮細胞誘導炎癥基因表達作用。此外,丙泊酚也能拮抗CCL4對內皮細胞促血栓基因表達的作用。目前,丙泊酚調控細胞內重要分子的研究報導較多,包括信號通路、非編碼RNA及表觀遺傳調控[24-26]。丙泊酚拮抗CCL4細胞毒作用、拮抗CCL4誘導細胞炎癥反應和促血栓形成反映可能與丙泊酚調控分子網絡有關,有待進一步研究。

綜上所述,CCL4可對腦微血管內皮細胞有細胞毒作用,細胞增殖活力及細胞克隆形成能力下降、細胞凋亡率增加;CCL4還能促進腦微血管內皮細胞炎癥反應及促血栓形成相關基因表達上調,而丙泊酚可抑制CCL4上述作用,可為丙泊酚作為減少腦卒中患者二次損傷保護劑提供實驗依據。