重癥監(jiān)護(hù)病房新生兒重癥聯(lián)合免疫缺陷病篩查結(jié)果及致病基因突變分析*

楊 曉,朱麗娜,馬 寧,李 昊,楊茹萊

1.中國人民解放軍總醫(yī)院兒科醫(yī)學(xué)部/中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心兒科研究所/出生缺陷防控關(guān)鍵技術(shù)國家工程實驗室,北京 100700;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院遺傳與代謝科/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/國家兒童區(qū)域醫(yī)療中心,浙江杭州 310052

重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)是由一系列基因突變導(dǎo)致細(xì)胞免疫和體液免疫同時受累的X-連鎖/常染色體隱性遺傳罕見病,是導(dǎo)致兒童生長發(fā)育障礙甚至死亡的嚴(yán)重遺傳性出生缺陷[1-2]。SCID在活產(chǎn)新生兒中的發(fā)病率為1/50 000～1/30 000[3],大部分SCID 患者在出生時缺乏明顯特異性表現(xiàn),由于自身存在嚴(yán)重的免疫功能障礙,常因接種卡介苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗等活疫苗而出現(xiàn)致死性不良結(jié)局,如不及時糾正免疫缺陷和采取干預(yù)措施,大部分患者在1～2 歲內(nèi)死亡[4]。由于SCID患兒多存在T細(xì)胞數(shù)減少或缺乏,實時熒光定量PCR檢測干血斑T細(xì)胞受體切除環(huán)(TREC)拷貝數(shù)的方法可用來進(jìn)行新生兒SCID篩查。TREC是T細(xì)胞在胸腺發(fā)育過程中編碼T細(xì)胞受體(TCR)基因重組時產(chǎn)生的小片段游離環(huán)狀DNA,穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi),不隨T細(xì)胞分裂而復(fù)制,可反映胸腺輸出初始T淋巴細(xì)胞數(shù)量。TREC拷貝數(shù)水平越低,表明體內(nèi)新生成的T細(xì)胞數(shù)量越少,患SCID的可能性越大[5],這種檢測TREC拷貝數(shù)的方法具有較高的靈敏度和特異度。一項涉及美國11個州320萬新生兒的篩查數(shù)據(jù)顯示,SCID的發(fā)病率為1/56 000[6],瑞典相關(guān)研究報道的SCID發(fā)病率為1/42 700[7-8]。研究顯示,浙江省新生兒疾病篩查中心對浙江地區(qū)61 479例新生兒進(jìn)行了SCID、X-連鎖無丙種球蛋白血癥(XLA)和脊髓性肌萎縮癥(SMA)3種遺傳性疾病的聯(lián)合篩查,在篩查陽性新生兒中經(jīng)血生化及基因檢測確診1例SCID患兒[9]。各國報道的SCID發(fā)病率雖然有一定差異,但由于我國人口基數(shù)較大,每年新生人口多,預(yù)計每年新增SCID患兒可達(dá)百例。

SCID篩查通常是在普通新生兒中開展的,目前尚鮮見研究針對NICU新生兒這一特殊群體開展此項篩查,本研究回顧性地檢測227例NICU新生兒的干血斑TREC拷貝數(shù),并通過全外顯子測序?qū)σ伤脐栃缘男律鷥哼M(jìn)行分子遺傳學(xué)診斷,探討在NICU新生兒中進(jìn)行SCID疾病早篩查、早診斷的意義,分析新生兒性別、胎齡、出生體重及感染情況對TREC拷貝數(shù)檢測結(jié)果的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年11月16日至2020年6月9日在解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)療中心新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(NICU)住院的227例新生兒作為研究對象,按性別分為男性組(137例)、女性組(90例)。同時,按胎齡分為7組[10]:超早產(chǎn)兒組(<28周)、極早產(chǎn)兒組(28～31+6周)、中期早產(chǎn)兒組(32～33+6周)、晚期早產(chǎn)兒組(34～36+6周)、早期足月兒組(37～38+6周)、完全足月兒組(39～40+6周)、晚期足月兒組(41～41+6周);按出生體重分為7組[10]:超低出生體重兒組(<1 000 g)、極低出生體重兒組(1 000～<1 500 g)、低出生體重兒組(1 500～<2 500 g)、正常出生體重兒組1(2 500～<3 000 g)、正常出生體重兒組2(3 000～3 500 g)、正常出生體重兒組3(3 500～<4 000 g)、巨大兒組(≥4 000 g)。為驗證NICU病房中患感染性疾病的足月兒是否多于早產(chǎn)兒,按胎齡將所有新生兒分為足月兒組(≥37周)和早產(chǎn)兒組(<37周),根據(jù)是否患感染性疾病,分為感染組和非感染組。

本研究已獲得中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理編號:2023-11)。納入的研究對象不再重新采集干血斑樣本,僅對其在實驗室留存的已用于遺傳代謝篩查的剩余干血斑樣本進(jìn)行TREC拷貝數(shù)檢測。

1.2儀器與試劑 實時熒光定量PCR儀(Quant Studio-6);全自動核酸檢測反應(yīng)體系構(gòu)建系統(tǒng)(Neostation);高通量測序儀(Illumina Nextseq 2000);血液基因組DNA提取試劑盒(Tiangen);NeoMDxTMkit 試劑盒(Wallac Oy);全外顯子基因捕獲探針V4.0(GenCap?)。

1.3方法

1.3.1SCID篩查方法 (1)血斑DNA提取:將樣本和質(zhì)控卡片常溫放置至少30 min后開始打孔,根據(jù)布板要求進(jìn)行樣本和質(zhì)控品的打孔(使用直徑3.2 mm打孔沖頭),每塊微孔板必須有兩組質(zhì)控(BL、C1、C2、C3),分別位于第一個樣本之前和最后一個樣本之后。按血斑DNA提取操作SOP進(jìn)行DNA提取,提取后進(jìn)行PCR儀器設(shè)置或封口儲存。(2)多重實時熒光定量PCR檢測:通過多重實時熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù),檢測干血斑DNA樣本中的2個靶標(biāo)序列TREC和RPP30,其中RPP30作為監(jiān)測樣本擴(kuò)增過程的內(nèi)部對照.此外,2個濃度質(zhì)控-低濃度TREC和高濃度TREC則作為整個檢測過程的對照。完成擴(kuò)增后,導(dǎo)出每個樣本(包括質(zhì)控)的Ct值,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀,篩查陽性結(jié)果以每105個細(xì)胞TREC拷貝數(shù)≤326為cut-off值。

1.3.2全外顯子測序及數(shù)據(jù)分析 篩查陽性的新生兒,從干血濾紙片提取DNA。使用標(biāo)準(zhǔn)文庫構(gòu)建試劑盒進(jìn)行基因組文庫構(gòu)建。質(zhì)檢合格后采用全外顯子基因捕獲探針,對富集文庫進(jìn)行高通量測序,獲得原始測序數(shù)據(jù),通過生物信息分析,篩選可能與SCID相關(guān)的基因突變位點。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0 軟件包對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和處理。不符合正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示,兩組比較采用Mann-WhitneyU檢驗,多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,采用χ2檢驗。胎齡和體重與TREC拷貝數(shù)的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同性別組TREC拷貝數(shù)比較 男性組新生兒TREC拷貝數(shù)為1 270(711,1 926),女性組新生兒TREC拷貝數(shù)為1 478(798,2 054)。兩組TREC拷貝數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.805,P=0.421)。

2.2不同胎齡組TREC拷貝數(shù)比較 相關(guān)性分析結(jié)果顯示,胎齡與TREC拷貝數(shù)無相關(guān)性(r=-0.033,P=0.618);7組不同胎齡新生兒TREC拷貝數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(H=8.611,P=0.197);見表1。但繪圖發(fā)現(xiàn),TREC拷貝數(shù)隨著胎齡的增加有增加趨勢,見圖1。

圖1 TREC拷貝數(shù)隨著胎齡增加的變化趨勢

表1 不同胎齡組TREC拷貝數(shù)比較

2.3不同出生體重組TREC拷貝數(shù)比較 相關(guān)性分析結(jié)果顯示,體重與TREC拷貝數(shù)無相關(guān)性(r=0.008,P=0.902)。7組不同出生體重新生兒TREC拷貝數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。但TREC拷貝數(shù)隨著出生體重的增加有增加趨勢,見圖2。

圖2 TREC拷貝數(shù)隨著出生體重增加的變化趨勢

表2 不同出生體重組TREC拷貝數(shù)比較

2.4足月兒組和早產(chǎn)兒組重癥感染性疾病的發(fā)生情況分析 220例新生兒中,足月兒組140例,患感染性疾病的新生兒114例;早產(chǎn)兒組87例,患感染性疾病的新生兒52例。χ2檢驗結(jié)果顯示,足月兒中感染性疾病患兒比例顯著多于早產(chǎn)兒,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.808,P<0.05)。見表3。

表3 足月兒組和早產(chǎn)兒組重癥感染性疾病發(fā)生情況[n(%)]

2.5感染組和非感染組TREC拷貝數(shù)比較 感染組與非感染組TREC拷貝數(shù)分別為1 397±888、1 811±1 095,感染組TREC拷貝數(shù)顯著低于非感染組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.996,P=0.004)。

2.6全外顯子測序結(jié)果 全外顯子測序及數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),篩查陽性的16例新生兒均檢測出至少2個常見的ADA突變位點,見表4。根據(jù)ACMG的基因突變命名規(guī)則,ADA基因上的突變位點可描述為:NM_000022.4(ADA)C.95+165A>G;NM_000022.4(ADA)C.36G>A(p.Val12);NM_000022.4 (ADA)C.363-165T>C。存在ADA純合突變或復(fù)合雜合突變是SCID的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。因此,這16例篩查陽性新生兒均可確診為SCID患兒。

表4 16例篩查陽性新生兒全外顯子測序結(jié)果

3 討 論

SCID是原發(fā)性免疫缺陷病(PID)中最嚴(yán)重的類型,而且80%以上的患者都在嬰兒期發(fā)病,如未能及時進(jìn)行免疫重建,大多數(shù)患兒會死亡。NICU是集中治療危重新生兒的病室,NICU新生兒通常患有肺炎、化膿性感染、各種腦炎、敗血癥等較為嚴(yán)重的感染性疾病,同時由于新生兒本身器官及免疫功能發(fā)育不健全,加上病情危重,侵入性操作多,也更易發(fā)生院內(nèi)感染,甚至是多重耐藥菌感染。AMATUNI等[7]對新生兒SCID的篩查結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),562例新生兒檢測結(jié)果為陽性,其中有53%(298例)篩查結(jié)果陽性的新生兒來自于NICU,對初篩陽性新生兒進(jìn)行外周血流式細(xì)胞術(shù)分析后,最終有6例確診為SCID,真陽性率高達(dá)2%。所以,NICU新生兒可能是罹患SCID的高危人群。同時,造血干細(xì)胞移植(HSCT)是目前治療SCID最成熟和有效的方法[8,11],而重度感染不僅是導(dǎo)致SCID患兒死亡的主要原因,也是SCID患兒失去HSCT治療機(jī)會的主要原因。陳靜[12]研究報道指出,由于就診時間晚、移植時感染重,5 例 SCID 患兒經(jīng)HSCT 治療后僅1例(20%)患兒存活。因此,NICU新生兒應(yīng)該作為開展SCID篩查的重點人群,以到達(dá)早篩查、早診斷、早治療的目的。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同性別的NICU新生兒TREC拷貝數(shù)無明顯差異,目前尚缺乏新生兒性別是否影響TREC拷貝數(shù)的相關(guān)報道,然而,有多項研究通過流式細(xì)胞術(shù)對外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行精確分型,測定總淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞各亞群[總T細(xì)胞(CD3+)、輔助T細(xì)胞(CD4+)、細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD8+)、B淋巴細(xì)胞(CD19+)等]的絕對/相對計數(shù)來探討男性與女性新生兒之間的外周血淋巴細(xì)胞亞群是否存在差異。在性別是否影響外周血淋巴細(xì)胞亞群這一問題上,這些研究結(jié)果未達(dá)成一致。AMATUNI等[13]研究認(rèn)為,不同種族/民族背景、不同性別的新生兒(包括早產(chǎn)兒和足月兒)在總淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)上無明顯區(qū)別;王文第等[14]研究顯示,男性和女性新生兒CD3+細(xì)胞百分比無明顯差異,但是CD4+、CD8+細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而詹文麗等[15]的研究指出,0歲至學(xué)齡前兒童不同性別CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD19+細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此,TREC作為胸腺輸出的T淋巴細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物,性別是否會影響其拷貝數(shù)的檢測結(jié)果仍有待繼續(xù)探討。

通過檢測TREC拷貝數(shù)來進(jìn)行新生兒SCID篩查雖然具有高度的敏感性和特異性,但是也有諸多因素可以導(dǎo)致假陰性和假陽性結(jié)果。Digeorge綜合征、21-三體綜合征、Ataxia綜合征等多種綜合征可使TREC拷貝數(shù)偏低,從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果[16];而由于TCR 重排之后的相關(guān)基因(IL-2Rγ、CD40L、ZAP70、DOCK8、MHC-Ⅱ等)突變導(dǎo)致的SCID,其胸腺結(jié)構(gòu)和功能正常,還有泄漏性SCID(leaky SCID)以及由RAG1/2基因亞型突變(多為錯義突變)導(dǎo)致的Omenn綜合征,可保留部分蛋白質(zhì)功能,均會使篩查出現(xiàn)假陰性結(jié)果[17]。此外,還有研究指出,早產(chǎn)兒和低出生體重兒可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少癥(TCL),從而使TREC拷貝數(shù)水平降低,這種TCL隨著胎齡和體重的增加可以得到糾正[7]。

本研究結(jié)果顯示,雖然NICU新生兒胎齡和出生體重與TREC拷貝數(shù)無相關(guān)性,但是隨著二者的增加,TREC拷貝數(shù)呈增加的趨勢。在按胎齡分組對TREC拷貝數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析時,極早產(chǎn)兒組、晚期早產(chǎn)兒組TREC拷貝數(shù)均高于超早產(chǎn)兒組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明早產(chǎn)兒的胎齡增加,TREC拷貝數(shù)水平也增加;而不同出生體重新生兒的TREC拷貝數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可能原因是低出生體重兒,尤其是超低和極低出生體重兒的樣本量小。

本研究還發(fā)現(xiàn),早產(chǎn)兒4個組的TREC拷貝數(shù)均高于足月兒3組,低出生體重兒4個組的TREC拷貝數(shù)也均高于正常出生體重兒3個組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨后,本課題組分析了所有新生兒的病歷資料,140例足月兒(幾乎也都是正常體重兒)中,有114例(81.40%)患感染性疾病,并且是患有新生兒敗血癥、新生兒重癥肺炎、新生兒化膿性腦膜炎等嚴(yán)重的感染性疾病,而40.20%的早產(chǎn)兒(幾乎也都是低出生體重兒)則是由于單純的早產(chǎn)、低出生體重或呼吸窘迫而入院治療的,統(tǒng)計學(xué)結(jié)果也顯示,患感染性疾病的足月新生兒多于早產(chǎn)兒,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時,感染組和非感染組TREC拷貝數(shù)比較發(fā)現(xiàn),感染組TREC拷貝數(shù)顯著低于非感染組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。嚴(yán)重的感染導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞數(shù)量激升,淋巴細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)減少,應(yīng)該是TREC拷貝數(shù)顯著降低的原因。這也提示,當(dāng)SCID篩查結(jié)果出現(xiàn)陽性時,要考慮新生兒的實際情況,避免假陽性結(jié)果的發(fā)生。這一結(jié)果,也可以解釋為什么早產(chǎn)兒各組或低出生體重兒各組的TREC拷貝數(shù)要高于足月兒各組或正常出生體重兒各組。

在227例NICU新生兒中,檢測發(fā)現(xiàn)每105個細(xì)胞TREC拷貝數(shù)<326的新生兒有16例,即SCID篩查疑似陽性的新生兒16例,對這16例新生兒的全外顯子測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),每例新生兒都攜帶2個常見的腺苷脫氨酶(ADA)基因突變,可確診為ADA-SCID。ADA-SCID是最常見的常染色體隱性遺傳SCID,約占SCID總病例數(shù)的15%,約占常染色體隱性遺傳SCID的50%,屬于T-B-NK-SCID[18],據(jù)統(tǒng)計,該病發(fā)病率在1/1 00萬～1/20萬活產(chǎn)兒之間[19]。

ADA基因位于20q13-qter,編碼一條含363個氨基酸殘基的多肽鏈,目前已報道超過65種 ADA 基因突變,其中近 70%為錯義突變,其余為無義突變及剪接突變[20]。ADA 是一種嘌呤回收酶,參與嘌呤核苷的代謝,幾乎在人體所有組織細(xì)胞中都有表達(dá),因淋巴細(xì)胞分裂迅速,其在淋巴樣組織,特別是胸腺中具有非常高的活性。ADA 缺乏引起的嘌呤代謝障礙,使底物腺苷(Ado)、脫氧腺苷(dAdo)及脫氧腺苷核苷酸(dAXP)等在血漿、紅細(xì)胞及淋巴組織中積聚,從而通過不同機(jī)制損害淋巴細(xì)胞的發(fā)育,導(dǎo)致成熟T、B淋巴細(xì)胞的嚴(yán)重不足,引發(fā)SCID。ADA-SCID可導(dǎo)致患者感音神經(jīng)性聽力損失、骨骼缺陷和神經(jīng)發(fā)育缺陷,但其免疫學(xué)表現(xiàn)可能危及生命,因此,以早發(fā)性及致死性嬰兒期發(fā)病最為常見。在本研究中,這16例 NICU新生兒均在新生兒期死亡,也符合ADA-SCID的臨床特點。

多重?zé)晒舛縋CR檢測TREC拷貝數(shù)為SCID的早期篩查提供了技術(shù)支持,應(yīng)用全外顯子測序技術(shù)可篩選SCID致病基因,并明確診斷篩查疑似陽性新生兒為SCID患兒。在NICU這一特殊群體中實施SCID早期篩查,早期診斷,并盡早對確診患兒開展治療,對于改善SCID患兒的生存質(zhì)量,提高SCID患兒生存率,進(jìn)而降低新生兒的死亡率都有重要意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染可能導(dǎo)致SCID篩查結(jié)果出現(xiàn)假陽性,在解釋結(jié)果時應(yīng)充分考慮新生兒的感染狀況。雖然本研究僅發(fā)現(xiàn)新生兒的胎齡與TREC的拷貝數(shù)測量結(jié)果相關(guān),但這可能是由于研究對象數(shù)量較少導(dǎo)致的,所以,性別、胎齡和出生體重與TREC拷貝數(shù)的關(guān)系仍需在擴(kuò)大樣本量后深入研究和驗證。