PFKFB4、CXCL8與宮頸癌臨床病理特征的關系及在預后評估中的臨床價值*

丁文艷,陳亞軍,王 平

1.南京醫科大學附屬婦產醫院/南京市婦幼保健院檢驗科,江蘇南京 210004;

2.江蘇省腫瘤醫院腫瘤內科,江蘇南京 210009

宮頸癌(CESC)是威脅女性健康的常見婦科惡性腫瘤,發病率僅次于乳腺癌、結直腸癌和肺癌[1]。腫瘤細胞侵襲力強、惡性程度高、易復發和遠處轉移是限制CESC療效和影響預后的主要因素[2]。結合CESC患者的臨床病理特征,尋找新型有效的生物標志物來預測CESC不良預后,對指導臨床治療策略、監測復發、提高療效具有十分重要的意義。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶 4(PFKFB4)基因編碼的蛋白質通過糖酵解的變構調節來調控糖酵解和磷酸戊糖途徑代謝通量,以滿足腫瘤細胞惡性增殖的生物需求,因此,PFKFB4可作為惡性腫瘤的預后標志物及潛在的治療靶標,具有較高的臨床研究價值[3]。CXC趨化因子配體8(CXCL8)作為一種重要的多功能趨化細胞因子,以自分泌或旁分泌的方式與腫瘤微環境中的細胞相互作用,促進腫瘤細胞的生長、侵襲、遠處轉移及血管生成,基于此CXCL8有望成為某些惡性腫瘤具有預后評估價值的分子靶標[4]。本研究通過檢測CESC組織中PFKFB4、CXCL8的表達水平,分析PFKFB4、CXCL8表達水平與CESC患者臨床病理特征及預后的相關性,旨在明確二者在CESC患者不良預后評估中的臨床價值,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年12在南京醫科大學附屬婦產醫院/南京市婦幼保健院(以下簡稱本院)接受根治性手術的62例CESC患者作為研究對象;年齡36～70歲,平均(54.34±8.87)歲;TNM分期:Ⅰa/Ⅰb期38例,Ⅱa期24例;腫瘤最大徑≤3 cm 44例,>3 cm 18例;分化程度:低分化24例,中/高分化38例;宮頸浸潤深度≥2/3 26例,宮頸浸潤深度<2/3 36例;病理類型:鱗癌50例,非鱗癌12例。納入標準:(1)參照《宮頸癌診斷與治療指南(第四版)》,經陰道鏡檢查、宮頸組織活檢、術后病理學確診為CESC;(2)入組前未接受CESC相關放、化療和免疫治療;(3)臨床資料和隨訪資料完整。排除標準:(1)合并其他系統惡性腫瘤者;(2)合并心、肝、腎等器官功能不全者;(3)合并認知障礙及精神性疾病者。本研究經醫院倫理委員會審核批準并獲得患者知情同意。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法檢測PFKFB4、CXCL8蛋白表達 采用免疫組織化學SP法(上海經科化學科技有限公司)檢測PFKFB4、CXCL8蛋白表達水平。手術獲取宮頸癌組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存。將腫瘤組織以10%甲醛溶液固定、脫水、包埋后,制成4～5 μm石蠟切片。PFKFB4和CXCL8抗體均購于Abcam公司(稀釋度1∶200)。二氨基聯苯顯色后,蘇木精復染,以組織細胞核或細胞質中出現棕褐色或棕黃色顆粒判定為PFKFB4和CXCL8蛋白陽性表達。染色強度評分如下:0分(組織無著色);1分(組織呈淡黃染色);2分(組織呈棕黃染色);3分(組織呈棕褐染色)。陽性細胞占比如下:0分(<5%),1分(5%～25%),2分(>25%～50%),3分(>50%～75%),4分(>75%)。以細胞染色強度與陽性細胞占比乘積>6分為高表達,0～5分為低表達。

1.2.2CESC患者隨訪 隨訪時間為3年。隨訪采用門診復診或電話回訪方式,以首次手術日期為隨訪開始時間,隨訪截止時間為2022年12月30日。將CESC患者術后復發/轉移或死亡定義為預后不良。

1.2.3基因表達譜數據動態分析(GEPIA)數據庫分析PFKFB4、CXCL8基因在CESC中的表達 從GEPIA在線網站(http://gepia.cancer-pku.cn/)上獲取306例CESC組織和13例正常對照組織中PFKFB4、CXCL8的表達情況。

1.2.4Kaplan-Meier Plotter數據庫對PFKFB4、CXCL8基因與CESC患者預后的相關性分析 利用Kaplan-Meier Plotter平臺(http://www.kmplot.com)分析不同PFKFB4和CXCL8表達水平CESC患者生存情況,組間比較采用Log-rank檢驗。

1.3統計學處理 采用SPSS25.0軟件進行統計學分析。計數資料以例數或百分率[n(%)]表示,采用χ2檢驗進行兩組間比較。采用多因素Logistic回歸模型分析CESC不良預后的危險因素,采用受試者工作特征(ROC)曲線對CESC不良預后模型的預測效能進行評價,采用Kaplan-Merier生存曲線及Log-rank檢驗比較生存情況。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同PFKFB4、CXCL8表達水平CESC患者生存情況比較 通過GEPIA在線數據庫對306例CESC組織和13例正常對照組織中PFKFB4、CXCL8表達水平進行分析,結果顯示,CESC組織中PFKFB4和CXCL8表達水平高于正常對照組織(P<0.05),見圖1。Kaplan-Meier曲線生存分析表明,隨著PFKFB4和CXCL8表達水平升高,CESC患者生存率降低,差異有統計學意義(Log-rankP=0.028、1.5×10-5),見圖2。PFKFB4和CXCL8的風險比(HR)分別為1.7、2.9(HR>1為疾病的危險因素),提示PFKFB4和CXCL8高表達是CESC患者不良預后的危險因素。

注:*P<0.05。

圖2 不同PFKFB4和CXCL8表達水平CESC患者生存情況比較

2.2PFKFB4、CXCL8表達水平與臨床病理特征的關系 CESC患者的臨床病理參數中,PFKFB4、CXCL8表達水平在不同TNM分期、腫瘤分化程度、宮頸浸潤深度及淋巴結轉移患者中比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。而PFKFB4、CXCL8表達水平在不同年齡、腫瘤最大徑、肌層浸潤及病理類型CESC患者中比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數CESC患者PFKFB4、CXCL8表達水平比較[n(%)]

2.3CESC患者不良預后的多因素分析 Logistic回歸分析結果顯示,TNMⅡa期、腫瘤低分化程度、宮頸浸潤深度≥2/3、有淋巴結轉移及PFKFB4、CXCL8高表達是CESC患者不良預后的危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響CESC不良預后的危險因素分析

2.4CESC不良預后風險預測模型評分規則及ROC曲線驗證 采用參考邏輯評分法,將CESC不良預后風險預測模型轉化為風險評分體系。依據Logistic回歸方程中最小的偏回歸系數(1.310)為基數,賦值為1分,其他變量賦值得分為每個自變量的偏回歸系數除以最小的偏回歸系數所的數值,取整數部分,總計評分為0～7分,其中,0～2分為低風險,3～5分為中風險,6～7分為高風險。采用ROC曲線對CESC不良預后風險預測模型的能力進行評估,AUC為0.872(95%CI:0.763～0.943,P<0.001),見圖3及表3。以Youden指數最大值為最佳臨界點,該預測模型靈敏度為0.925 9,特異度為0.828 6,提示該模型對CESC不良預后風險預測效果較好。

表3 CESC不良預后風險評分

注:預警模型由TNM分期、分化程度、宮頸浸潤深度、淋巴結轉移、PFKFB4表達、CXCL8表達共6項指標構建。

3 討 論

CESC發生發展是由多基因、多因素參與的復雜的病理生理過程,宮頸上皮細胞的非典型增生導致原位癌的形成,CESC在晚期表現出轉移性或復發性的惡性攻擊性行為,且部分CESC患者對化療不敏感,總體預后較差,5年生存率相對較低[5-7]。因此,結合CESC的分子生物學特征和組織病理學特征,迫切需要尋找敏感性好、特異性高的生物標記物,早期預測腫瘤的轉歸和預后,以獲得更好的治療策略,對CESC患者進行指導治療。有報道顯示,PFKFB4基因促進小細胞肺癌的化療耐藥與不良預后關系密切,是小細胞肺癌潛在的治療靶點及化療敏感性的預測因子[8]。另一項研究表明,膀胱癌組織中PFKFB4基因高表達,誘使腫瘤細胞代謝異常,沉默PFKFB4基因表達或使用PFKFB4基因的阻斷劑有望成為膀胱癌新型的治療策略,這為膀胱癌的治療提供新的研究方向[9]。HAN等[10]研究發現,CXCL8基因表達與上皮間質轉化和細胞基質血管化密切相關,由此促進腫瘤細胞的侵襲和轉移,這在一定程度上解釋了CXCL8基因具有預測腫瘤轉移的能力。

本研究從生物信息學分析及組織層面分析了PFKFB4和CXCL8的表達水平及其與CESC的臨床病理特征的緊密關系。在線GEPIA數據庫分析顯示,CESC組織中PFKFB4和CXCL8表達水平顯著高于正常對照組織。然而,GEPIA在線網站并未提供306例CESC組織的臨床病理特征,為了彌補GEPIA在線網站的不足之處,本研究對62例CESC患者組織中PFKFB4和CXCL8表達水平與CESC患者臨床病理特征(包含年齡、腫瘤最大徑、TNM分期、腫瘤分化程度、宮頸浸潤深度、淋巴結轉移、肌層浸潤及病理類型)的關系進行分析。本研究結果表明,過表達PFKFB4和CXCL8與CESC患者TNM Ⅱa期、腫瘤低分化程度、宮頸浸潤深度≥2/3及有淋巴結轉移密切相關。生存曲線分析結果顯示,隨著PFKFB4和CXCL8表達水平升高,患者的生存率降低。本研究將PFKFB4和CXCL8與CESC進展聯系起來,并將PFKFB4和CXCL8高表達作為CESC患者不良預后的重要危險因素。PFKFB4參與了CESC的發生發展,可能與PFKFB4在許多實體腫瘤中過表達,通過加強腫瘤細胞的糖酵解通量,調控自噬形成和細胞周期進程,促進血管生成、腫瘤侵襲和轉移等過程有關[11-13]。由此推測,PFKFB4在CESC進展中發揮了重要作用,是CESC不良預后潛在的新型預測因子。CXCL8通過促進上皮向間充質轉化、引發中性粒細胞外陷阱的形成以及促進血管生成途徑導致腫瘤侵襲和遠處轉移,研究顯示,CXCL8基因表達與腫瘤轉移具有很強的相關性并能準確預測腫瘤轉移[14-16]。由此推測,CXCL8是另外一種潛在的CESC預后相關生物標志物和治療靶點。

綜上所述,CESC患者組織中PFKFB4、CXCL8呈高表達,二者能夠成為TNM期、腫瘤分化程度、宮頸浸潤深度及淋巴結轉移等臨床病理特征的有力補充,由此構建的CESC不良預后風險模型具有良好的評估效果,能夠指導臨床醫生精準評估CESC預后,有效監測高風險人群,進行早期預防和及時治療,有助于降低CESC復發、轉移風險,因此具有重要的臨床應用價值。