不同級別膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白的陽性表達情況及臨床意義

甘 杰,文擘彬,楊 晗,王 爭△

1.湖南省長沙市第四醫院神經外科,湖南長沙 410000;2.中南大學湘雅醫院神經外科,湖南長沙 410000

腦膠質瘤是一種生長迅速、侵襲性較強的原發性顱內腫瘤,其發病機制涉及多個信號通路的異常激活和調控失衡[1]。膽堿激酶α(CHKα)、細胞外信號調節激酶(ERK)及絲裂原激活蛋白激酶(MEK)是細胞信號通路中的關鍵蛋白,它們均參與了細胞的增殖、生存、分化等多個生物學過程,惡性腫瘤中異常活化的信號通路通常與腫瘤的發生和發展密切相關[2]。MEK/ERK信號通路是一個主要的細胞增殖和生存信號傳導通路,而CHKα則在細胞周期調控和DNA損傷修復中發揮關鍵的調節作用,這些蛋白的表達水平是否可以作為膠質瘤的生物標志物,且是否有助于對不同級別的膠質瘤進行分類和預測患者的生存狀況還有待考察。臨床通常使用基因表達水平的定量數據來定義MEK、ERK和CHKα等基因的高表達和低表達狀態。基于此,本研究采用免疫組織化學法檢測不同級別膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白的陽性表達情況,判斷其預后價值,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2019年1月至2022年12月長沙市第四醫院神經外科收治的124例膠質瘤患者的臨床資料,其中男64例(51.61%),女60例(48.39%);年齡10～75歲,平均(43.58±11.03)歲。根據世界衛生組織(WHO)膠質瘤的分級標準將其劃分為Ⅰ～Ⅳ級[3]。納入標準:(1)所有患者均經病理學檢查診斷符合膠質瘤診斷標準[4];(2)血液、尿液、大便、肝功能、腎功能、心功能檢查均無異常。排除標準:(1)疾病類型為復發性膠質瘤或接受過分子靶向藥物及放化療治療的患者;(2)合并心、肝、肺、腎等實質性臟器病變或其他惡性腫瘤患者。本研究經長沙市第四醫院醫學倫理委員會審核批準(201810-013)。

1.2MEK、ERK、CHKα蛋白表達情況檢測方法 根據患者膠質瘤發生的不同功能區進行切除,并采用3.7%甲醛溶液固定和脫水包埋切除組織,隨后進行染色。采用免疫組織化學法對上述組織實施抗原修復及脫蠟,再用封閉液封閉2 h,加入MEK、ERK、CHKα抗體溫育2 h,使用磷酸鹽緩沖液洗凈后加入相應種屬二抗。并將蘇木精和二氨基聯苯胺顯色液加入實施常規復染,隨后給予封片和干燥,同時觀察MEK、ERK、CHKα蛋白的表達情況。在400倍光學顯微鏡下任意選取6個視野,每個視野觀察100個細胞。MEK、ERK、CHKα蛋白表達情況以細胞膜/細胞核/細胞質中出現著色視為陽性細胞。陽性細胞百分數評分標準:陽性細胞數≤5%為0分;>5%～20%為1分;>20%～50%為2分;>50%為3分。著色程度強弱評分標準:無著色為0分;輕度著色為1分;中度著色為2分,重度著色為3分。MEK、ERK、CHKα蛋白表達情況評估:陽性細胞百分數評分和著色程度強弱評分總分為0分為“-”,總分為1～2分為“+”,定義為MEK、ERK、CHKα蛋白表達陰性(低表達);總分為3～4分為“++”,總分為5～6分為“+++”,定義為MEK、ERK、CHKα蛋白表達陽性(高表達)。

1.3免疫組織化學法判讀標準 采用Capture 2.1顯微鏡圖片采集軟件選取3個染色均勻且不相鄰的高倍視野(×400)進行拍照,以陽性細胞百分數和著色強度作為標準,對所有觀察到的陽性細胞實施計數,并對陽性細胞的百分數進行計算,取其平均值。

1.4隨訪情況 術后醫務人員需指導患者準時來院進行放化療,注意飲食營養補充,避免進食辛辣生冷食物,并以電話的方式對參加本研究的患者進行追蹤隨訪。主要觀察患者有無新并發癥出現等。患者生存時間以住院手術后經病理檢查證實時間為起始,停止時間為患者死亡或隨訪終止時。

1.5統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析處理。計數資料以例數或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同臨床病理特征膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白表達情況比較 不同年齡、WHO分級、腫瘤最大徑及預后膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白高、低表達情況比較,差異均有統計學意義(P<0.05);不同性別、腫瘤位置、吸煙情況膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白高、低表達情況比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白表達情況比較[n(%)]

2.2Ⅰ～Ⅳ級膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白陽性表達率比較 124例膠質瘤患者中Ⅰ級33例,Ⅱ級27例,Ⅲ級31例,Ⅳ級33例。MEK、ERK、CHKα蛋白主要分布在細胞質內,Ⅰ～Ⅳ級膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白陽性表達率見表2。高級別膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白陽性表達率較低級別膠質瘤患者更高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1、2、3。

圖1 膠質瘤患者CHKα蛋白的表達(從左至右依次為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級,×400)

圖2 膠質瘤患者ERK蛋白的表達(從左至右依次為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級,×400)

圖3 膠質瘤患者MEK蛋白的表達(從左至右依次為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級)

表2 Ⅰ～Ⅳ級膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白陽性表達率比較(%)

2.3隨訪情況 隨訪時間截止于2022年12月30日,124例患者中失訪12例(9.68%),獲得隨訪112例(90.32%),死亡52例(41.94%)。

2.4Kaplan-Meier生存曲線分析 Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示,MEK、ERK、CHKα蛋白低表達膠質瘤患者均較MEK、ERK、CHKα蛋白高表達患者累計生存率更高,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4、5、6。

圖4 MEK蛋白低表達和高表達膠質瘤患者生存曲線

圖5 ERK蛋白低表達和高表達膠質瘤患者生存曲線

圖6 CHKα蛋白低表達和高表達膠質瘤患者生存曲線

3 討 論

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤之一,具有高度異質性和侵襲性,嚴重影響患者的生活質量和預后。目前根據病理學特征及分子生物學標志,膠質瘤主要分為多種亞型,其中Ⅰ級為良性腫瘤,Ⅳ級為高度惡性腫瘤。不同級別的膠質瘤具有明顯的生物學差異,包括細胞增殖速度、血管生成、細胞凋亡等,這種差異可能與細胞內信號通路的激活狀態有關[5-6]。MEK/ERK信號通路和CHKα是研究的焦點,它們在細胞生存、增殖和凋亡等方面發揮關鍵作用。

MEK/ERK信號通路作為一個重要的細胞信號傳導通路,參與調控細胞的增殖、分化、生存和凋亡等生命活動,在膠質瘤中,MEK/ERK信號通路的異常激活與腫瘤的發生和發展密切相關。有研究發現,不同級別的膠質瘤患者MEK和ERK蛋白表達存在差異,提示這一通路在膠質瘤分級過程中可能起關鍵的調控作用[7]。此外,CHKα是細胞周期檢查點激酶之一,參與細胞周期的調控和DNA損傷修復,膠質瘤中CHKα的異常表達與細胞的DNA損傷應答和凋亡抵抗性有關,其在維持細胞染色體穩定性和基因組完整性中扮演重要角色[8]。然而,目前針對不同級別的膠質瘤,MEK、ERK和CHKα的表達及其在腫瘤生物學過程患者的作用尚未得到充分研究。了解不同級別膠質瘤中這些分子的表達情況及它們在調控細胞生物學功能中的作用,對于深入理解膠質瘤的分子機制、尋找潛在的治療靶點及制訂個性化治療策略具有重要臨床意義。基于此,本研究以不同級別膠質瘤患者作為研究對象,對其腫瘤組織中MEK、ERK、CHKα蛋白表達進行觀察分析,通過對不同級別膠質瘤組織樣本的免疫組織化學染色和分子生物學試驗,系統探討它們對膠質瘤發生、發展及預后的潛在影響,結果顯示,其各亞型膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白的表達在彌漫性星形細胞瘤與少突膠質瘤或同級別之間無明顯差別。基于此,本研究只選擇了其中一種類型的膠質瘤作為研究方向,結果顯示,高級別膠質瘤患者MEK、ERK、CHKα蛋白陽性表達率明顯高于低級別患者。可能與高級別膠質瘤通常具有更高的細胞增殖能力、侵襲性和治療抵抗性有關,高級別膠質瘤的細胞增殖速度更快,具有更強的侵襲性,而MEK、ERK和CHKα信號通路在細胞增殖和侵襲過程中發揮重要作用,因此其表達增加可能支持這些惡性特征。

本研究結果還顯示,MEK、ERK、CHKα蛋白的表達與腫瘤最大徑、年齡、WHO分級存在明顯相關性,腫瘤最大徑≤6 mm、WHO分級為Ⅲ～Ⅳ級、年齡≥65歲膠質瘤患者腫瘤組織中MEK、ERK、CHKα蛋白表達明顯高于腫瘤最大徑>6 cm、WHO分級為Ⅰ～Ⅱ級、年齡<65歲的患者。原因可能包括以下幾點:(1)腫瘤最大徑較大常表示腫瘤已經發展到了更晚期,其細胞增殖和侵襲性更強;(2)WHO分級反映了腫瘤的分化程度和組織學特征,Ⅲ～Ⅳ級腫瘤通常是高度惡性的,細胞分化程度低,而Ⅰ～Ⅱ級腫瘤的惡性程度則相對較低,不同級別的腫瘤細胞可能在蛋白表達方面存在差異,高級別腫瘤可能表現出更高的MEK、ERK、CHKα蛋白表達;(3)年齡是一個重要的生理特征,不同年齡段的個體在腫瘤發展和生物學特征方面可能存在差異,年齡≥65歲的患者可能受到年齡相關的生理變化和免疫功能下降的影響,導致腫瘤細胞中MEK、ERK、CHKα蛋白表達升高。有研究表明,MEK、ERK、CHKα蛋白的高表達在一定程度上會使患者發生不良預后的可能性增加[9-10]。也有研究發現,MEK、ERK、CHKα蛋白的高表達與腫瘤患者的復發和死亡風險有關[11-12]。從上述不同研究結論來看,目前臨床尚不完全清楚MEK、ERK、CHKα蛋白在膠質瘤患者中的高表達對其預后及作用機制的影響。本研究發現,高級別膠質母細胞瘤中MEK、ERK、CHKα蛋白高表達較多,但在Ⅰ級星形細胞瘤中較少(P<0.05)。這可能是因為MEK/ERK信號通路的過度活化可能會導致細胞增殖和生長異常加速,高級別膠質母細胞瘤中CHKα蛋白低表達可能會導致DNA損傷修復機制失調,使細胞更容易發生不穩定和突變,從而加速腫瘤發展,并且其表面形態與患者的疾病預后可能有一定關系[13-14]。本研究結果顯示,CHKα蛋白低表達患者累計生存率更高,差異有統計學意義(P<0.05),可能與CHKα蛋白的低表達降低了腫瘤細胞的生存優勢及減緩了腫瘤的進展有關,CHKα作為一個細胞周期調控的關鍵分子,它的低表達使腫瘤細胞更容易受到治療的影響[15]。WHO分級為Ⅲ級和Ⅳ級是高級別膠質瘤,并且通常會采取術中全切與術后放化療聯合進行治療,盡管現如今已有多種對高級別膠質瘤進行治療的方案,但效果均不是特別理想,且患者術后復發率仍居高不下[16]。此外,大多數患者在被確診或發覺異常時已處于疾病中晚期或腫瘤已轉移或已擴散,極難再通過外科手術完全切除[17]。所以,早期診斷和更精確地觀察對于改善膠質瘤患者的預后十分關鍵。但目前由于臨床樣本量太少,還需擴大樣本量實施進一步研究。

綜上所述,MEK、ERK、CHKα蛋白在不同級別膠質瘤患者中的陽性表達情況有明顯區別,且與患者的疾病預后明顯相關,對其疾病的診斷和預后判斷具有重要價值。