IL-17 mRNA和PGE2 mRNA在口腔扁平苔蘚患者中的表達(dá)水平及臨床意義*

李 陽,王 瓏

寧夏醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院,寧夏銀川 750001

口腔扁平苔蘚(OLP)是一種常見的口腔黏膜疾病。根據(jù)組織有無糜爛分為糜爛型OLP和非糜爛型OLP。其中,糜爛型OLP表現(xiàn)為口腔常伴有明顯的灼燒感和疼痛,嚴(yán)重影響患者語言、進(jìn)食和吞咽功能。此外,糜爛型OLP若久治不愈,可能發(fā)展為口腔癌[1]。因此,世界衛(wèi)生組織將其列為口腔潛在惡性疾病之一[2]。雖然目前尚未完全明確OLP的發(fā)病機(jī)制,但是越來越多的研究證明免疫失調(diào)在OLP發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,特別是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和各種炎癥分子的異常表達(dá)等免疫失調(diào)[3]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)是Th家族的最新成員,可分泌白細(xì)胞介素(IL)-17等特異性細(xì)胞因子,并與炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4]。在OLP的發(fā)展過程中,浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞合成并分泌多種促炎性細(xì)胞因子,促使OLP患者產(chǎn)生炎癥反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致糜爛、潰瘍及疼痛等臨床表現(xiàn),表明OLP的發(fā)展與促炎性細(xì)胞因子的激活有關(guān)[5-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),OLP患者外周血血清中IL-17、血管表皮生長(zhǎng)因子表達(dá)水平均高于健康者,提示IL-17和血管表皮生長(zhǎng)因子可能參與OLP的發(fā)病過程,但具體機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)一步探究[8]。前列腺素E2(PGE2)作為炎癥介質(zhì)參與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程,并可以活化樹突狀細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子/趨化因子,但在自身免疫性疾病中,PGE2主要被認(rèn)為是一種促炎性細(xì)胞因子[9]。此外,有研究報(bào)道,IL-17和PGE2在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、血管生成等過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。而PGE2和IL-17在OLP發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制目前仍不清楚。因此,本研究主要探討了IL-17和PGE2的信使RNA(mRNA)在OLP患者中的表達(dá)水平與臨床意義,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年3月至2021年3月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔醫(yī)院收治的35例OLP患者作為試驗(yàn)組,另選取同期在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔醫(yī)院進(jìn)行阻生牙拔除的20例患者作為對(duì)照組。根據(jù)組織是否糜爛,將試驗(yàn)組患者分為糜爛型OLP組和非糜爛型OLP組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《口腔扁平苔蘚診療指南(修訂版)》[3]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)未接受任何相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并全身系統(tǒng)性疾病或惡性腫瘤;(2)伴有牙齦炎或牙周炎等口腔疾病。試驗(yàn)組男16例,女19例;年齡32～71歲,平均(48.3±15.5)歲。對(duì)照組男9例,女11例;年齡21～43歲,平均(32.5±9.2)歲。試驗(yàn)組和對(duì)照組性別、年齡比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(寧醫(yī)大倫理第2020-270號(hào))。

1.2儀器與試劑 美國賽默飛世爾NanoDrop One 超微量紫外分光光度計(jì),美國賽默飛ProFlex 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀。RNAlater液和RNAeasyTMRNA抽提試劑盒均購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司;PCR引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成;反轉(zhuǎn)錄試劑盒Time PrimeScript?RT kit和熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ均購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采集試驗(yàn)組患者口腔黏膜病損組織及對(duì)照組患者口腔黏膜組織標(biāo)本,置于RNAlater液,在4 ℃冰箱過夜后,再置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?液氮研磨組織后,使用RNAeasyTMRNA抽提試劑盒,提取RNA。美國賽默飛世爾NanoDrop One超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度后合成互補(bǔ)DNA(cDNA),根據(jù)RNA濃度,配制反轉(zhuǎn)錄體系,按照產(chǎn)品說明書,將合成的cDNA存于-20 ℃冰箱中備用。IL-17正向引物序列為5′-CTGAATATCCATAACCGGAATACC-3′,反向引物序列為5′-AGCGTTGATGCAGCCCAAG-3′;PGE2正向引物序列為5′-CACAATCTCAAAGGGCCATC-3′,反向引物序列為5′-ATGGTACACACCGTGGCATA-3′;GAPDH正向引物序列為5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-3′,反向引物序列為5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3′。PCR反應(yīng)體系為TB Green Fast qPCR Mix(2X) 10.0 μL,PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.5 μL,PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.5 μL,cDNA 2.0 μL,碳酸二乙酯(DEPC)水 7.0 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為95 ℃,1 min;95 ℃,15 s;60 ℃,30 s ;循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-17和PGE2在試驗(yàn)組患者口腔黏膜病損組織及對(duì)照組患者口腔黏膜組織中mRNA的表達(dá)水平,重復(fù)3次取平均值。

1.3.2評(píng)估患者疼痛程度 根據(jù)中華口腔醫(yī)學(xué)會(huì)黏膜病專業(yè)委員會(huì)于2022年制定的《口腔扁平苔蘚診療指南(修訂版)》[3],采用視覺模擬評(píng)分法(VAS)評(píng)估患者的疼痛程度,讓患者在0～10分自行選擇一個(gè)最能代表其疼痛程度的分?jǐn)?shù),0分代表無疼痛,1～3分代表輕度疼痛,4～6分代表中度疼痛,7～10 分代表重度疼痛。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組、非糜爛型OLP組、糜爛型OLP組IL-17 mRNA和PGE2 mRNA表達(dá)水平比較 非糜爛型OLP組有19例患者,糜爛型OLP組有16例患者。糜爛型OLP組IL-17 mRNA和PGE2 mRNA表達(dá)水平均高于非糜爛型OLP組和對(duì)照組,且非糜爛型OLP組均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 對(duì)照組、非糜爛型OLP組、糜爛型OLP組IL-17和PGE2的mRNA表達(dá)水平比較

2.2OLP患者IL-17 mRNA與PGE2 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,OLP患者IL-17 mRNA表達(dá)水平與PGE2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.505,P=0.002)。

2.3不同疼痛程度的OLP患者IL-17 mRNA和PGE2 mRNA表達(dá)水平比較 試驗(yàn)組中無疼痛患者有5例,輕度疼痛患者有6例,中度疼痛患者有16例,重度疼痛患者有8例。無疼痛OLP患者IL-17 mRNA和PGE2 mRNA表達(dá)水平均低于輕度、中度、重度疼痛OLP患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同疼痛程度的OLP患者IL-17 mRNA和PGE2mRNA表達(dá)水平比較

2.4OLP患者IL-17 mRNA和PGE2 mRNA表達(dá)水平與疼痛程度的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示,OLP患者IL-17 mRNA、PGE2 mRNA表達(dá)水平與疼痛程度均呈正相關(guān)(r=0.710、0.570,P<0.05)。

3 討 論

OLP是臨床常見的與免疫相關(guān)的慢性炎癥性口腔黏膜病。糜爛型OLP有轉(zhuǎn)化為口腔鱗癌的風(fēng)險(xiǎn),一旦發(fā)生癌變,會(huì)嚴(yán)重影響患者的身心健康。OLP的病理特點(diǎn)為固有層有大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及基底細(xì)胞發(fā)生液化變性,提示T淋巴細(xì)胞參與OLP的發(fā)生、發(fā)展過程[2]。有研究報(bào)道,Th17會(huì)產(chǎn)生多種促炎性細(xì)胞因子,在銀屑病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥性疾病中發(fā)揮了重要作用,并與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)[12]。此外,Th17分泌的IL-17會(huì)促使上皮細(xì)胞、固有層中的成纖維細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,從而協(xié)同促進(jìn)炎癥的發(fā)生、發(fā)展[13]。

本研究發(fā)現(xiàn),糜爛型OLP組、非糜爛型OLP組IL-17 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示OLP患者體內(nèi)的Th17數(shù)量增加。糜爛型OLP組IL-17 mRNA表達(dá)水平高于非糜爛OLP組(P<0.05),提示與非糜爛型OLP患者相比,糜爛型OLP患者體內(nèi)含有更多的IL-17細(xì)胞。謝三祥等[14]研究發(fā)現(xiàn)OLP患者體內(nèi)存在大量的Th17細(xì)胞浸潤(rùn)。CD8+T淋巴細(xì)胞在糜爛型OLP患者的糜爛部位聚集增多、活性增強(qiáng),并通過分泌人干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、IL-17等細(xì)胞因子加重OLP患者口腔部位糜爛[15]。因此,筆者推斷OLP患者IL-17 mRNA表達(dá)水平升高是因?yàn)榫植凯h(huán)境中淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。本研究結(jié)果顯示,OLP患者IL-17 mRNA表達(dá)水平與疼痛程度呈正比(r=0.710,P<0.05),提示OLP患者IL-17 mRNA表達(dá)水平越高,疼痛癥狀越明顯。表明OLP患者上皮和固有層中的Th17被抗原呈遞細(xì)胞激活并釋放IL-17并促進(jìn)炎癥反應(yīng),引起相應(yīng)的疼痛等生物學(xué)效應(yīng)。提示Th17產(chǎn)生的IL-17在OLP中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

本研究發(fā)現(xiàn),糜爛型OLP組、非糜爛型OLP組PGE2 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且與OLP患者的疼痛程度呈正相關(guān)(r=0.570,P<0.05),提示PGE2 mRNA表達(dá)水平越高,OLP患者疼痛越明顯。而且糜爛型OLP組PGE2 mRNA表達(dá)水平比非糜爛型OLP組高(P<0.05)。分析原因?yàn)樵贠LP患者體內(nèi)的Th17刺激固有層中的樹突狀細(xì)胞從而分泌大量的PGE2,并募集固有層的細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子,導(dǎo)致基底細(xì)胞發(fā)生空泡性變,上皮細(xì)胞發(fā)生糜爛,這可能是臨床OLP患者口腔組織發(fā)生糜爛并伴疼痛的原因之一。Th17通過分泌環(huán)氧化酶-2誘導(dǎo)PGE2發(fā)揮擴(kuò)血管作用,也能促進(jìn)炎癥細(xì)胞分泌炎癥因子,從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)生和發(fā)展[11]。MUKAE等[16]通過免疫組化反應(yīng)檢測(cè)OLP患者的環(huán)氧化酶-2和微粒體前列腺素E合酶-1(mPGES-1)表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),OLP病變的角質(zhì)形成細(xì)胞中環(huán)氧化酶-2和mPGES-1的表達(dá)水平較正常的口腔上皮細(xì)胞高,與本研究結(jié)果相似。在研究小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的模型中PGE2類似物(米索前列醇)的作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn),PGE2促進(jìn)了樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-6,并誘導(dǎo)IL-23/IL-12平衡的轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致IL-17水平上升,提示PGE2可能是通過放大自身反應(yīng)性Th17細(xì)胞作用,從而加重小鼠關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)[17]。此外,IL-17和PEG2還可能與乳腺癌、肺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[18-20]。

綜上所述,OLP患者口腔黏膜病損組織中IL-17 mRNA、PGE2 mRNA表達(dá)水平均高于正常的口腔黏膜組織,且糜爛型OLP組織IL-17 mRNA、PGE2 mRNA表達(dá)水平均高于非糜爛型OLP組織,并且與OLP患者的疼痛程度呈正相關(guān),提示其可能參與了OLP的發(fā)生和發(fā)展過程。因此,闡明IL-17/PGE2軸在OLP中發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,尋找可能有效的治療靶點(diǎn),減少OLP發(fā)展為口腔癌的風(fēng)險(xiǎn),有助于預(yù)防和管理OLP。