新型抗菌肽Mt-22S3對白念珠菌細胞的作用及機制*

李彩多, 曾曄, 石艷萍, 張迎春, 吳建偉, 陳崢宏, 王濤*

(1．貴州醫科大學 基礎醫學院, 貴州 貴陽 550025; 2．貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室, 貴州 貴陽 550025)

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是生物先天免疫系統中抵抗病原微生物感染的小分子功能多肽[1]。AMPs因其高效地抑制真菌、細菌及病毒等病原微生物的特性,以及不易引起病原微生物產生耐藥性等優點,在感染性疾病治療領域備受矚目,有望成為傳統抗生素的有力替代品[2-6]。因此,深入探究AMPs的作用機理,對于揭示其生物特性、研發新型抗菌藥物具有至關重要的意義。研究表明,AMPs不僅對細胞壁和細胞膜產生影響,還可能對細胞內部的細胞器和功能分子產生影響[7-11]。 AMPs來源豐富,不同種類的AMPs作用機制也不盡相同,家蠅抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A,MAF-1A)突變體-22S3(mutant-22S3 of MAF-1A,Mt-22S3)是本課題組對發現的MAF-1A進行構效優化后所獲得的新型AMPs分子,前期研究表明,其模板肽MAF-1A可通過作用于白念珠菌(Candidaalbicans,C.albicans)細胞內結構來發揮抗C.albicans效果[11],但Mt-22S3是否能影響C.albicans細胞內部結構和功能分子尚不清楚。因此,本研究深入探究Mt-22S3在C.albicans細胞內的作用機制,為AMPs的開發和利用提供理論基礎和實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1AMPsMt-22S3 委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl,FMOC)固相法制備多肽(批次為P27963),并經過反相高效液相色譜純化譜 、液相色譜-質譜技術進行測試,多肽純度為98%以上。

1.1.2實驗菌株C.albicansATCC10231由貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室提供。

1.1.3主要試劑及儀器 沙氏葡萄糖瓊脂培養基(sabouraud dextrose agar,SDA)和肉湯培養基(sabouraud dextrose broth,SDB;杭州百思),活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒、線粒體膜電位測定試劑盒、異硫氰酸熒光素-膜聯蛋白/碘化丙啶 (fluoresceine isothiocyanate-annexin-V/propidium iodide,FITC-Annexin-V/PI)細胞凋亡檢測試劑盒及真菌DNA提取試劑盒(北京Solarbio);正置熒光顯微鏡(日本尼康ci-e-ds-r11),熒光多功能酶標儀(中國SYNERGY),凝膠成像系統(美國IQuant400)。

1.2 研究方法

1.2.1菌株的活化及菌懸液配制 采用分區劃線法將-80 ℃凍存的C.albicans接種于SDA平板,37 ℃溫箱中培養;無菌操作下挑取對數生長期C.albicans菌落置于SDB中,以細胞計數法配制菌懸液。

1.2.2Mt-22S3對C.albicans細胞內ROS影響的檢測 取對數生長期的C.albicans菌懸液,與終濃度為0、125、250及500 mg/L Mt-22S3作用后,放置于37 ℃溫箱培養12 h,4 000 r/min離心5 min,獲取C.albicans菌體,經無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS;pH=7.4)洗滌3次,棄上清液,保留菌體沉淀物。按試劑盒方法,加2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA)于37 ℃培養箱中避光染色30 min,PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌并重懸,使用正置熒光顯微鏡拍照和記錄結果,熒光多功能酶標儀于488 nm激發光、525 nm發射光下檢測熒光強度。

1.2.3Mt-22S3對C.albicans線粒體膜電位作用的檢測 取對數生長期的C.albicans菌懸液,與終濃度為0、125、250及500 mg/L Mt-22S3作用,同時設氧化磷酸化解偶聯劑(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,cccp)作為陽性對照,放置于37 ℃溫箱培養12 h,4 000 r/min離心5 min,獲取C.albicans菌體,經染色工作液洗滌3次,棄上清液,保留菌體沉淀物。按試劑盒方法加染色工作液,37 ℃培養箱中避光染色20 min,染色緩沖液洗滌并重懸3次。采用多功能酶標儀檢測熒光強度,設置485 nm激發波長,將發射波長從525 nm(綠光、FL1)轉換為590 nm(紅光、FL2),并通過計算熒光比值判斷線粒體膜電位變化。

1.2.4Mt-22S3對C.albicans細胞凋亡的影響 取對數生長期的C.albicans菌懸液,與終濃度為0、125、250及 500 mg/L Mt-22S3作用,置于37 ℃溫箱培養12 h,4 000 r/min離心5 min,獲取C.albicans菌體,經無菌PBS洗滌3次,棄上清液,保留菌體沉淀物。依照試劑盒方法作FITC-Annexin-V/PI 染色,通過正置熒光顯微鏡觀察并記錄結果。

1.2.5Mt-22S3對C.albicansDNA條帶遷移率的影響 按“1.2.1”中方法培養的對數生長期C.albicans,依據真菌DNA提取試劑盒方法提取DNA并檢測其純度。將C.albicansDNA分別與終濃度為0、125、250、500 mg/L AMPsMt-22S3混合,于37 ℃培養箱培養3 h取出。將各組樣品與6×Loading Dye混合均勻后進行瓊脂糖凝膠電泳,并運用凝膠成像分析儀觀察和記錄結果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞內ROS含量

熒光顯微鏡下可見,125 mg/L Mt-22S3處理12 h后,C.albicans細胞內開始產生綠色熒光,即出現ROS累積現象;Mt-22S3濃度增加時,出現綠色熒光的C.albicans細胞數大量增加(圖1A)。多功能酶標儀檢測結果顯示,隨著Mt-22S3濃度逐漸升高,C.albicans細胞的平均熒光強度逐漸增高;當Mt-22S3濃度達250 mg/L、500 mg/L時,C.albicans細胞的平均熒光強度較0 mg/L Mt-22S3組升高(P<0.05或P<0.01,圖1 B)。

注：A為熒光顯微鏡下ROS的表達(1 000×),B為ROS的定量表達;(1)與0 mg/L Mt-22S3組比較,(1)P<0.05, (2)P<0.01。

2.2 線粒體膜電位

結果顯示,與0 mg/L Mt-22S3組比較,陽性對照cccp作用于C.albicans后,可見菌細胞線粒體的FL2∶FL1的比值明顯減小,線粒體膜電位降低(P<0.000 1);125、250及500 mg/L Mt-22S3作用C.albicans后,均可以導致菌細胞線粒體的熒光比值較0 mg/L Mt-22S3組明顯減小(P<0.01),且隨著Mt-22S3濃度的升高,菌細胞線粒體熒光比值隨之減小,線粒體膜電位降低越明顯(圖2)。

2.3 細胞凋亡

熒光顯微鏡下可見(圖3),125、250及500 mg/L AMPsMt-22S3作用于C.albicans后,菌細胞均可出現帶有紅色熒光的壞死菌細胞和帶有綠色熒光的凋亡菌細胞,且隨著Mt-22S3濃度的增高,出現紅色或綠色熒光C.albicans細胞不斷增多,呈劑量依賴性。

注：紅、綠及黃色熒光分別表示壞死、早期凋亡及晚期凋亡菌細胞。

2.4 Mt-22S3對DNA的影響

當C.albicans的DNA與250及500 mg/L Mt-22S3作用3 h 后,相較于0 mg/L Mt-22S3組,出現了明顯的凝膠阻滯現象,導致大量C.albicansDNA被阻塞在凝膠加樣孔附近,同時DNA電泳條帶呈現出不同程度的變暗;此外,隨著AMPs Mt-22S3濃度的增加,DNA條帶的亮度也逐漸減弱。見圖4。

注：1～4表示Mt-22S3濃度依次為 0、125、250及500 mg/L。

3 討論

ROS是在細胞在代謝過程中自然生成的具有化學活性的含氧分子,正常生理條件下在細胞信號傳遞和體內平衡中起著重要作用[12]。但是各種環境壓力可導致ROS增加,從而對細胞造成嚴重的破壞。有研究顯示,過量ROS可通過破壞多種細胞功能分子(包括核酸、蛋白質及脂質)、增加細胞膜通透性等方式導致細胞死亡[13]。有研究表明,誘導ROS的產生是抗真菌藥物的一種普遍作用方式,有助于抗真菌藥物殺傷病原微生物[14-17]。不同的抗真菌藥物,包括咪康唑、兩性霉素B可以促使細胞內ROS含量增加來殺滅C.albicans[14-15]。有研究表明,AMPs可以影響線粒體氧化還原平衡,誘導ROS的產生和積累,而ROS的積累則會導致C.albicans的死亡[16-17]。Seyedjavadi等[16]研究表明,高濃度AMPs MCh-AMP1作用C.albicans細胞后,菌細胞內可產生大量ROS,表明MCh-AMP1可通過誘導ROS的產生,導致細胞內氧化損傷。本研究結果顯示,250 mg/L、500 mg/L Mt-22S3作用后,染上綠色熒光的C.albicans細胞明顯增多,熒光強度增高(P<0.05),提示經Mt-22S3作用的C.albicans細胞內ROS大量增加,表明一定濃度的Mt-22S3也能誘導C.albicans細胞產生大量ROS,提示Mt-22S3可通過誘導細胞內ROS的產生而發揮抗C.albicans作用。

線粒體是能量代謝的重要細胞器,而能量代謝又與細胞生理學和完整性密切相關。研究表明,細胞內ROS的產生和積累能引發細胞線粒體膜電位去極化,導致線粒體功能障礙[18]。此外,大量的ROS會對線粒體的結構組成造成嚴重損害,進而影響線粒體膜的完整性。文獻報道,某些AMPs可以使C.albicans細胞內大量產生ROS,引起線粒體膜電位去極化,使線粒體膜完整性破壞,從而導致線粒體失去其正常的生物學功能[19]。本研究中,使用熒光染料檢測C.albicans細胞內線粒體膜電位的變化,結果表明,經過不同濃度的Mt-22S3作用后,C.albicans細胞內線粒體膜電位呈現逐漸降低的趨勢,Mt-22S3作用濃度越高,C.albicans細胞內線粒體膜電位去極化越明顯(P<0.01),上述結果表明,Mt-22S3可以使線粒體膜電位降低,引起線粒體的去極化現象,進而對線粒體的正常功能造成損害。

近年來研究表明,ROS是細胞凋亡的關鍵調節因子,ROS的產生是凋亡途徑啟動相關的早期因素之一,高水平的ROS會使線粒體膜去極化,而線粒體膜的去極化在細胞凋亡中起著重要作用[18-20]。Chen等[21]研究顯示,AMPs hep25誘導C.albicans細胞內產生ROS,使線粒體膜電位降低,導致線粒體膜電位去極化,最后誘導C.albicans凋亡;Ma等[22]發現AMP-17導致ROS水平增加、線粒體膜電位的去極化及細胞周期的變化,最終導致C.albicans細胞凋亡和壞死。正常情況下,磷脂酰絲氨酸分布于細胞膜內側,即與細胞質相鄰的一側,當細菌處于凋亡初期時,這些磷脂酰絲氨酸會被翻轉到細菌膜外[22];Annexin Ⅴ屬于Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,可以特異性結合凋亡細胞中翻轉到膜外的磷脂酰絲氨酸,在激發光作用下,與凋亡細胞磷脂酰絲氨酸結合的Annexin Ⅴ-FITC可使細胞出現綠色熒光[22]。PI是一種熒光核酸染料,不能穿透完好無損的細胞膜,可透過破損的細胞膜進入壞死的細胞內,使細胞產生紅色熒光[23]。本研究中,Mt-22S3作用于C.albicans細胞后可促使菌細胞產生綠色或紅色熒光,表明Mt-22S3不僅可以使C.albicans細胞磷脂酰絲氨酸外翻,還能破壞細胞膜完整性,增加細胞膜通透性,從而提示Mt-22S3可以使C.albicans細胞產生細胞凋亡和細胞壞死現象。念珠菌中的細胞凋亡主要通過2條途徑發生,第一種是半胱氨酸蛋白酶依賴性途徑,第二種是半胱氨酸蛋白酶非依賴性途徑[19-20]。ROS增加、線粒體功能障礙及鈣離子的積累是激活半胱氨酸蛋白酶依賴性途徑使細胞凋亡的重要因素。由本研究結果可見,Mt-22S3可以使C.albicans細胞大量產生ROS,引起線粒體膜電位降低,線粒體功能受損,提示Mt-22S3可能通過半胱氨酸蛋白酶依賴性途徑誘導C.albicans發生細胞凋亡。

有研究顯示,某些AMPs進入菌體細胞內可通過靜電結合等方式與菌細胞DNA結合,導致菌細胞的正常生理功能受阻,從而發揮其抗菌活性[24]。有研究表明,瓊脂糖凝膠阻滯實驗的電泳遷移率可用于評估AMPs與菌細胞DNA之間的結合情況[11,25]。當AMPs與C.albicans的DNA分子結合時,其所形成的結合物在電泳中的遷移率將受到抑制,導致其出現滯后于單獨存在的DNA分子[11,25]。本研究凝膠電泳結果顯示,相較于陰性對照,與Mt-22S3共孵育的DNA出現顯著的凝膠阻滯現象,大量C.albicans的DNA 被阻止并停滯在凝膠加樣孔附近,結果表明Mt-22S3進入細胞后與C.albicans細胞的DNA分子發生了結合作用,從而阻撓DNA的復制等生理功能,最終發揮了抗C.albicans的效果。

綜上所述,Mt-22S3進入C.albicans細胞內后,可通過誘導胞內產生大量ROS、去極化線粒體、誘導凋亡、與DNA分子結合等方式破壞C.albicans細胞的正常生理機能,發揮抗C.albicans作用。