漢防己乙素衍生物LYY-47對三陰性乳腺癌細胞及其多倍體巨瘤細胞增殖、凋亡的作用和機制*

余曉靜, 張望明, 賀天輝, 劉小花,艾海鋒, 安麗君, 楊留啟, 潘衛東, 劉杰麟,5***

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 免疫學教研室, 貴州 貴陽 550025; 2.九江學院附屬醫院 檢驗科, 江西 九江 332000; 3.德江縣民族中醫院 檢驗科, 貴州 銅仁 565200; 4.貴州大學 藥學院, 貴州 貴陽 550025; 5.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室, 貴州 貴陽 550014)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發病率居女性惡性腫瘤之首,呈逐年上升的趨勢,并且趨于年輕化[1]。其中不表達雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)的乳腺癌稱為三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC),占所有乳腺癌的 15%～20%,對內分泌治療及 HER-2 的靶向治療往往不敏感,積極研制新型靶向治療藥物是臨床科研中亟待解決的問題。多倍體巨瘤細胞(polyploid giant cancer cells, PGCCs)是導致實體瘤異質性的一類特殊的癌細胞亞群,在多種癌癥細胞中已經發現了PGCCs 的存在,顯示出與腫瘤直接的相關性[2],且PGCCs及其子代細胞參與了上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關癌癥侵襲和轉移的發生,與乳腺癌的發生發展、轉移及治療耐藥相關[3]。有研究表明,PGCCs具有腫瘤干細胞的特性,能夠表達腫瘤干細胞標志物白細胞分化抗原44(cluster of differentiation 44,CD44)和白細胞分化抗原133(cluster of differentiation 133,CD133)[4],并可在體外形成球型體,導致免疫缺陷小鼠體內產生腫瘤[5]。在耐藥性方面,已有研究表明PGCCs對包括阿霉素、長春花堿及紫杉醇(paclitaxel,PTX)在內的常規化療藥物具有抵抗能力,PGCCs可以在這些藥物的極端劑量中存活,半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值是其親本細胞的10倍以上[6]。為了治療腫瘤的復發和轉移,必須消除促轉移、耐藥及腫瘤生長的PGCCs,所以尋找PGCCs的治療靶標就顯得尤為關鍵。Bloom(BLM) DNA 解旋酶作為人類RecQ家族解旋酶中的重要成員,參與了DNA的修復、復制及重組等過程,在維持端粒和染色體的穩定性中發揮著重要作用[7],且與乳腺癌、前列腺癌、結腸癌及卵巢癌等發生發展有著重要的關系[8]。此外,亦有研究顯示,小分子ML216 可抑制高表達BLM DNA解旋酶的癌細胞增殖[9]。漢防己乙素是從防己科植物粉防己的根中提取的單體化合物,具有抗炎鎮痛、降血壓等藥理作用[10]。有研究表明,漢防己乙素可通過調節腫瘤細胞周期、促進凋亡相關基因的表達,對肝癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[11]。PGCCs是以有絲分裂失敗導致內復制或者細胞間的融合形成的單個巨核或者多核的細胞, BLM DNA解旋酶參與了DNA代謝的各個過程,但是目前尚無其與PGCCs相互關聯的報道。本研究擬探討BLM DNA解旋酶是否能夠成為抑制PGCCs及其子代細胞的有效靶點,尋找有效的小分子化合藥物,從而為臨床治療TNBC提供新的思路及線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞及動物來源 TNBC MDA-MB-231細胞和MDA-MB-436細胞購自中國科學院細胞庫;6周齡雌性無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級無胸腺BALB/c裸鼠12只,體質量18～20 g,購自北京斯貝福生物技術有限公司。本研究獲學校動物實驗倫理委員會批準[2200073,動物許可證號為SCXK(京)2019-0010]。

1.1.2主要試劑 漢防己乙素衍生物LYY-47由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室提供[純度>95%,配制溶劑為二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)],PTX(大連美侖公司),BLM特異性抑制劑ML216(美國APExBIO公司),L15培養基(上海中喬新舟公司),胎牛血清(以色列BI公司),1%青霉素鏈霉素雙抗、胰蛋白酶(美國Gibco公司),胰島素(武漢普諾賽公司),蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,H&E)染色試劑盒、噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)試劑、蛋白Marker、抗熒光衰減封片劑含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、中性樹膠、0.1%結晶紫染液、3,3-二氨基聯苯胺鹽酸鹽(3,3-N-diaminobenzidine tertrahydrochloride,DAB)顯色試劑盒(北京索萊寶公司),細胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡試劑盒(杭州聯科公司),二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天公司),細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)抗體、細胞周期蛋白B1(cell cycle protein B1 ,cyclin B1)抗體、Rad51抗體、BCL2-相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)抗體、B淋巴細胞瘤蛋白-2 (B-cell lymphoma protein2,Bcl-2)抗體、裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)抗體、裂解凋亡蛋白酶-8(cleaved Caspase-8)抗體(成都正能生物公司),CD44抗體、細胞周期調節蛋白-67(cell cycle regulatory proteins-67,Ki-67)抗體(北京博奧森公司),乙醛脫氫酶1A1(acetaldehyde dehydrogenase1A1,ALDH1A1)抗體、乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)抗體(美國Proteintech公司),CD133抗體、磷酸化組蛋白2AX(phosphorylation of histone 2AX,γ-H2AX)抗體(武漢博士德生物公司),BLM抗體(美國Santa公司),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔抗體和抗鼠抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的山羊抗鼠抗體(武漢塞維爾公司)。

1.1.3主要儀器 正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司),凝膠成像系統(上海天能公司),超微量微孔板分光光度計(美國biotek 公司),水平電泳儀(北京六一儀器廠),流式細胞儀(安捷倫生物公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養 MDA-MB-231細胞使用L15培養基培養,添加10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗;MDA-MB-436細胞使用L15培養基培養,添加20%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗以及20 U/100 mL胰島素完全培養基。

1.2.2PGCCs的形成 取“1.2.1”項下2種細胞融合度達到80%～90%時,加500 nmol/L PTX培養18 h,更換為不含PTX的完全培養基繼續培養,每3 天換液1次。

1.2.3H&E染色和PGCCs的計數 取“1.2.1”項下2種細胞以8×104個/孔接種于預先放入細胞爬片的24孔板中,誘導其形成PGCCs,每隔1天取出對應培養時間的細胞爬片;4%多聚甲醛固定細胞10 min,加蘇木素染液染色5 min,水洗;加伊紅染液染色1 min,稍稍水洗;自然晾干,中性樹膠封片;高倍鏡下(400×)選擇5個視野進行PGCCs計數,計算PGCCs平均數量并繪制PGCCs的形成曲線。

1.2.4流式細胞術檢測細胞周期 收集“1.2.1”項下MDA-MB-231細胞和“1.2.2”項下PGCCs子代細胞,以3×105個/孔均勻鋪于6孔板;設置對照組(0.00 μmol/L或DMSO)、LYY-47(6.50 μmol/L)給藥組,ML216(25 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L)給藥組,處理48 h; 收集各組細胞,1 000 r/min 離心 5 min,棄上清液,PBS洗滌;加 DNA Staining solution 1 mL和Permeabilization solution 10 μL ,混勻;室溫避光孵育 30 min,通過流式細胞儀檢測分析。

1.2.5Western blot檢測周期相關蛋白(CDK1、CyclinB1)、干性相關蛋白(ALDH1A1、CD44、CD133)、DNA損傷修復相關蛋白(BLM、Rad51、BRCA1)及凋亡相關蛋白(Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8)的表達 收集“1.2.1”項下對數生長期的MDA-MB-231細胞和“1.2.2”項下PGCCs子代細胞 ,以3×105個/孔均勻鋪于6孔板;設置對照組(0.00 μmol/L)、LYY-47(5.00 μmol/L)給藥組,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)裂解細胞,4 ℃低溫12 000 r/min離心15 min,取上清移至新的EP管;BCA法測定蛋白的濃度后將剩余蛋白與5×上樣緩沖液按4∶1的比例加樣混勻,100 ℃水浴加熱10 min;所得蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)分離,電轉移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜;5%脫脂奶粉封閉2 h,分別加入對應的 CDK1、CyclinB1、ALDH1A1、CD44、CD133、BLM、Rad51、BRCA1、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8抗體,4 ℃冰箱孵育過夜;三乙醇胺緩沖鹽水溶液/吐溫(tris buffered saline/ Tween,TBS/T)洗膜后根據一抗的來源分別加入對應的山羊抗鼠或者山羊抗兔二抗,室溫搖床孵育2 h;TBST洗膜,使用增強型化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影。

1.2.6MTT法檢測細胞活力 收集“1.2.1”項下對數生長期的MDA-MB-231細胞和“1.2.2”項下PGCCs子代細胞,按照1.0×104/孔的密度接種于96孔板;設置對照組(0.00 μmol/L)、LYY-47(1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L、10.00 μmol/L、20.00 μmol/L及30.00 μmol/L)給藥組、ML216(6.25 μmol/L、12.50 μmol/L、25.00 μmol/L、50.00 μmol/L及100.00 μmol/L)給藥組;培養特定時間后取出培養板,每孔加培養基100 μL 和MTT試劑10 μL ,避光孵育 4 h,每孔加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μL,37 ℃搖床上充分溶解結晶10 min,酶標儀于490 nm 波長處檢測各孔的光密度(optical density,OD)值。

1.2.7克隆形成實驗 收集“1.2.1”項下對數生長期的MDA-MB-231細胞和“1.2.2”項下PGCCs子代細胞,計數后以800個/孔接種于6孔板;設置對照組(0.00 μmol/L)、LYY-47(0.25 μmol/L、0.50 μmol/L及0.75 μmol/L)給藥組、ML216(0.625 μmol/L、1.250 μmol/L及2.500 μmol/L)給藥組。繼續培養12 d,終止培養,期間每2～3 天換液1次;棄原有培養液,PBS洗滌細胞2次;4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min,PBS洗滌2次;0.1%結晶紫染液染色20 min,自來水沖洗;空氣干燥,拍照,使用Image J軟件計數細胞集落數。

1.2.8細胞免疫熒光實驗檢測γ-H2AX的表達 收集“1.2.1”項下對數生長期的的MDA-MB-231細胞和“1.2.2”項下PGCCs子代細胞,以8×104個/孔接種于預先放入細胞爬片的24孔板中,待細胞長至合適的融合度后,4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min,0.3% Triton X-100室溫透化細胞20 min;5%山羊血清室溫封閉20 min;洗滌后加鼠抗γ-H2AX抗體(1∶400稀釋),放入濕盒,4 ℃冰箱孵育過夜;洗滌,加FITC標記的山羊抗鼠IgG(1∶100稀釋),37 ℃溫箱避光孵育30 min;洗滌,滴加適量含DAPI的封片劑于載玻片上,蓋上爬片,讓細胞接觸封片液,使用正置熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.9熒光偏振實驗檢測漢防己乙素衍生物對BLM DNA 解旋酶酶活性的影響 反應緩沖液(20 mmol/L Tris、25 mmol/L NaCl、3 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L DTT及pH 7.9)中加2 nmol/L熒光標記DNA [dsDNA或ssDNA (21 nt)],檢測熒光各向異性值,直至穩定;加不同濃度(0.00～6.67 μ mol/L)漢防己乙素衍生物,檢測熒光各向異性值,直至其穩定;加500 nmol/L BLM642-1290DNA解旋酶,使DNA底物浸泡后檢測熒光各向異性值,直至其穩定;記錄熒光各向異性值。漢防己乙素衍生物對BLM642-1290DNA解旋酶解鏈的影響采用相同的方法,漢防己乙素衍生物終濃度調整為0.00～33.34 μmol/L,最后加終濃度為0.2 mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)。

1.2.10ML216對MDA-MB-231細胞形成PGCCs的影響 收集“1.2.1”項下對數生長期的MDA-MB-231細胞,以3×105個/孔均勻鋪于6孔板,隔天細胞貼壁后,將細胞分為對照組、PTX組、ML216組及ML216+PTX組, ML216組和ML216+PTX組分別加3 μmol/L 的ML216,對照組和 PTX 組分別加入同等體積的完全培養基;各組細胞繼續培養48 h至細胞融合度達80%～90%后,PTX組加500 nmol/L PTX、ML216組加3 μmol/L ML216及ML216+PTX組分別加PTX和ML216至PTX藥物終濃度為500 nmol/L ,ML216藥物終濃度為3 μmol/L,對照組加入同等體積的完全培養基;置于培養箱培養18 h,無菌PBS輕輕洗滌2次, ML216組和ML216+PTX組加3 μmol/L ML216、對照組和PTX組加同等體積的完全培養基;繼續培養9 d,期間每2～3 天進行換液;到達培養時間后, PBS洗滌細胞2次,4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min,0.1%結晶紫染液染色20 min,自來水沖洗,使用Image J軟件計數細胞數。

1.2.11流式細胞術檢測細胞凋亡 收集“1.2.1”項下MDA-MB-231細胞和“1.2.2”項下PGCCs子代細胞,以3×105個/孔均勻鋪于6孔板;設置對照組(0.00 μmol/L)、LYY-47(2.50 μmol/L、5.00 μmol/L及6.50 μmol/L)給藥組,處理48 h;不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集細胞(包括培養上清中的細胞),預冷 PBS 離心洗滌2次;雙蒸水稀釋 5×Binding Buffer 為 1×工作液,取1×Binding Buffer 500 μL重懸各組細胞;每管加Annexin V-FITC 5 μL 和 PI 10 μL,吸頭吹吸混勻,室溫避光孵育 5 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.12皮下成瘤動物實驗 裸鼠皮下分別注射5×106個“1.2.1”項下的MDA-MB-231細胞和“1.2.2”項下誘導形成的PGCCs子代細胞,每隔3天測量1次腫瘤體積,測量29 d,頸椎脫臼處死裸鼠,剝離腫瘤,稱重并拍照;剝離的腫瘤組織浸泡于4%多聚甲醛制作石蠟切片,H&E染色和免疫組織化學染色觀察細胞形態并檢測BLM與Ki-67的表達。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 PTX誘導人乳腺癌細胞形成PGCCs及其子代細胞

人乳腺癌MDA-MB-231細胞和MDA-MB-436細胞經500 nmol/L PTX處理18 h,更換不含PTX的完全培養基繼續培養細胞,鏡下發現單個巨核或者多核的PGCCs;MDA-MB-231細胞繼續培養20～25 d時觀察到細胞通過出芽的方式產出了子代細胞,至27～35 d時產生了更多的子代細胞群體。誘導MDA-MB-436細胞形成PGCCs后,繼續培養9 d時,PGCCs同樣通過出芽的方式產出了子代細胞,至15～35 d時,子代細胞群體明顯,H&E染色計數了PTX處理后35 d內PGCCs百分比的變化情況,并繪制了MDA-MB-231 PGCCs的形成曲線,可以看到PTX處理后的20 d內, PGCCs的百分比逐漸增加,比例達100%后保持穩定;產生子代細胞后,PGCCs的百分比開始下降,直至趨于0%。見圖1。

注：A為MDA-MB-231細胞、MDA-MB-436細胞與各自 PGCCs及其子代細胞的形態(H&E,×400),B為500 nmol/L PTX處理MDA-MB-231細胞后產生PGCCs的定量結果。

2.2 細胞周期和細胞周期相關蛋白的表達

與未經誘導的細胞相比,MDA-MB-231細胞來源的PGCCs S期(P<0.01)和G2/M期細胞增加(P<0.05),其子代細胞則S期細胞增加(P<0.01),但G2/M期細胞減少(P<0.01);PGCCs 中G2/M期周期蛋白CDK1和CyclinB1表達均下調(P<0.05),子代細胞中的表達則上調(P<0.05)。見圖2。

注：A為細胞周期圖,B為細胞周期分布的定量結果,C、D為MDA-MB-231細胞和PGCCs及其子代細胞中CDK1、CyclinB1蛋白的表達及定量結果;與MDA-MB-231細胞組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.3 干性相關蛋白的表達和增殖能力

與MDA-MB-231細胞比較,PGCCs及其子代細胞中干性相關蛋白ALDH1A1、CD44及CD133表達上調(P<0.05),PGCCs子代細胞的增殖和克隆形成能力增強(P<0.05),PGCCs子代細胞中DNA損傷標志物γ-H2AX的表達上調(P<0.01)。見圖3。

注：A為MDA-MB-231細胞和PGCCs及其子代細胞中CD44、ALDH1A1、CD133的表達,B為干性相關蛋白定量結果,C為細胞克隆形成圖,D為MDA-MB-231細胞與PGCCs子代細胞生長曲線,E為細胞克隆形成數統計結果,F為MDA-MB-231細胞與PGCCs子代細胞中DNA損傷標志物γ-H2AX的表達(免疫熒光染色,×400),G為γ-H2AX熒光強度的定量結果;與MDA-MB-231細胞組比較,(1)P<0.01, (2)P<0.05。

2.4 BLM DNA解旋酶對PGCCs形成的影響

檢測MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞中DNA損傷修復相關蛋白的表達,結果顯示,PGCCs子代細胞中DNA損傷修復相關蛋白BLM、Rad51、BRCA1的表達均上調(P<0.05);進一步研究了藥物抑制BLM DNA解旋酶對PGCCs形成的影響,在用PTX誘導MDA-MB-231細胞形成PGCCs的過程中加入BLM DNA解旋酶抑制劑ML216,結果顯示,與PTX組相比,PTX+ML216組PGCCs的形成數目明顯減少(P<0.01)。見圖4。

注：A、B為Western blot檢測MDA-MB-231細胞與PGCCs子代細胞中BLM、Rad51及BRCA1蛋白的表達及定量結果,C為PGCCs形成數目的結晶紫染色圖(40×),D為PGCCs形成數目的統計結果;(1) 與MDA-MB-231細胞組比較,P<0.05;(2)與500 nmol/L PTX組比較,P<0.01。

2.5 MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞的裸鼠成瘤能力

檢測MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞的裸鼠成瘤能力,結果顯示,PGCCs子代細胞組瘤體的體積和重量均極明顯高于MDA-MB-231細胞組(P<0.001),PGCCs子代細胞組的腫瘤生長速度也明顯快于MDA-MB-231細胞組(P<0.01);PGCCs子代細胞組中BLM、增殖相關蛋白Ki-67均呈高表達(P<0.01)。見圖5。

注：A為MDA-MB-231細胞與PGCCs子代細胞小鼠移植瘤模型示意圖,B為裸鼠瘤體照片,C為腫瘤最終瘤體重量統計結果, D為腫瘤體積生長曲線,E為H&E染色和免疫組織化學染色檢測圖(紅色箭頭所指為Ki-67陽性細胞,DAB顯色,200×),F為Ki-67陽性細胞統計結果;與MDA-MB-231細胞組比較,(1)P<0.001,(2)P<0.01。

2.6 漢防己乙素衍生物LYY-47對BLM642-1290DNA解旋酶的酶活性及蛋白表達的影響

檢測LYY-47對 BLM642-1290DNA解旋酶酶活性的影響,結果顯示,LYY-47能夠使得BLM642-1290DNA解旋酶的DNA結合活性、ATPase活性及解鏈活性下調;且LYY-47作用于MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞后,細胞中DNA損傷修復相關蛋白BLM、Rad51、BRCA1的表達均下調(P<0.05)。見圖6。

注：A為LYY-47 對 dsDNA 的影響及BLM DNA解旋酶與 dsDNA 復合物的熒光各向異性值, B為 LYY-47 與 dsDNA 結合后對其與BLM DNA解旋酶 結合活性的影響,C 為 LYY-47對 ssDNA的影響及BLM DNA解旋酶與 ssDNA復合物的熒光各向異性值,D為LYY-47與 ssDNA結合后對其與 BLM DNA解旋酶結合活性的影響,E為LYY-47對BLM DNA解旋酶ATPase活性的影響,F為 LYY-47對BLM DNA解旋酶解鏈活性的影響,G為LYY-47對 BLM DNA解旋酶解鏈時間曲線的影響, H、I為LYY-47藥物處理后,MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞中BLM、Rad51、 BRCA1蛋白的表達及定量結果; A0 為 LYY-47 -DNA 復合物的熒光各向異性值,A1為BLM-LYY-47-DNA 復合物的熒光各向異性值,A2為加入終濃度0.2 mmol/L ATP 后反應體系的熒光各向異性值;與對照組比較,(1)P<0.001,(2)P<0.01,(3)P<0.05。

2.7 LYY-47和ML216對MDA-MB-231細胞和其PGCCs子代細胞增殖和克隆形成的影響

檢測LYY-47和ML216對正常乳腺上皮MCF-10A細胞、MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞增殖和克隆形成能力的影響,結果顯示,不同濃度的LYY-47和ML216作用于MCF-10A細胞、MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞后,細胞的增殖和克隆形成能力下調(P<0.05)。見圖7。

注：A、B、C為LYY-47處理后MCF-10A細胞、MDA-MB-231細胞及PGCCs子代細胞的OD值,D為LYY-47對MCF-10A細胞、MDA-MB-231細胞及PGCCs子代細胞增殖抑制的IC50, E、F為ML216處理后對MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞的OD值, G、H、I 為LYY-47對MDA-MB-231細胞、PGCCs子代細胞克隆形成能力的檢測結果和定量結果(結晶紫染色),J、K及L為ML216對MDA-MB-231細胞、PGCCs子代細胞克隆形成能力的檢測結果和定量結果(結晶紫染色);與對照組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001;(4) 與MCF-10A細胞比較,P<0.001。

2.8 LYY-47對MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞周期的影響

檢測LYY-47對MDA-MB-231細胞和其PGCCs子代細胞周期的影響,結果顯示,LYY-47能夠使得MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞G2 /M 期細胞數量增多(P<0.05),S 期細胞數量減少(P<0.05),將細胞阻滯于 G2/M期;與對照組相比,LYY-47給藥組CDK1 與 CyclinB1 的表達水平均被明顯抑制了(P<0.05)。見圖8。

注：A、B為LYY-47處理后MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞周期的檢測結果和定量結果,C、D為MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞中細胞周期相關蛋白CDK1、CyclinB1的表達和定量結果;與對照組比較, (1)P<0.05,(2)P<0.01。

2.9 ML216對MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞周期的影響

檢測ML216對MDA-MB-231細胞和其PGCCs子代細胞周期的影響,結果顯示,不同濃度ML216能夠引起MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞G1期細胞數量的增加(P<0.05),使得細胞難以進入S期,S期細胞數量減少(P<0.05)。見圖9。

注：A、B為ML216處理后MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞周期的檢測結果和定量結果;與DMSO組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05,(3)P<0.001。

2.10 LYY-47對MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響

檢測LYY-47對MDA-MB-231細胞和其PGCCs子代細胞凋亡的影響。結果顯示,與對照組相比,LYY-47給藥組的細胞總凋亡比例(總凋亡率=晚期細胞凋亡率+早期細胞凋亡率)增加(P<0.05);實驗組細胞經5 μmol/L LYY-47處理48 h后,檢測各組凋亡相關蛋白的表達;結果顯示,與對照組相比,LYY-47給藥組細胞中Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8的表達均上調(P<0.05),Bcl-2的表達則下調(P<0.05)。見圖10。

注：A、B為MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞的流式細胞術檢測結果和定量結果,C、D為MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 及cleaved Caspase-8的表達和定量結果;與對照組比較, (1)P<0.05,(2)P<0.001。

2.11 BLM DNA解旋酶對PGCCs及其子代細胞的影響

通過PTX誘導人乳腺癌MDA-MB-231/436細胞形成的PGCCs及其子代細胞的性狀以及LYY-47對MDA-MB-231細胞及其PGCCs子代細胞的影響總結如圖11所示。

注：↑表示上調,↓表示下調。

3 討論

以往研究表明,癌癥復發往往是耐藥亞群在初始治療后重新產生腫瘤的結果,而PGCCs就是這樣一個耐藥亞群,最近研究已證實其在癌癥進展中的相關性和重要性,它是導致實體瘤異質性的一類特殊的癌細胞亞群,治療壓力會誘導形成PGCCs,且PGCCs可通過不對稱分裂產生具有治療抗性的子代細胞[2,12-13]。本研究中,通過500 nmol/L PTX誘導TNBC MDA-MB-231和MDA-MB-436細胞產生PGCCs,并觀察到了PGCCs子代細胞的產生;采用H&E染色對PGCCs進行染色,根據Zhang等[14]對PGCCs的定義對PGCCs進行計數,并計算百分比,繪制了PGCCs的形成曲線;與MDA-MB-231細胞相比,PTX誘導MDA-MB-436細胞形成的PGCCs 數量較少,因此,目前沒有展開深入的研究。通過流式細胞術對MDA-MB-231細胞、PGCCs以及 PGCCs子代細胞進行細胞周期分析,進一步證實了PGCCs表現為多倍體和非整倍體以及經歷了G2/M期阻滯,PGCCs產生的子代細胞又回歸了二倍體屬性。CyclinB1 與 CDK1 是調控細胞周期 G2/M 期的核心蛋白,在DNA合成的后期細胞由S期向G2/M期過渡過程中依賴于CyclinB1 與 CDK1形成的復合物的調控,驅動G2期到M期的轉換[15]。結果顯示,與MDA-MB-231細胞相比,PGCCs 中CyclinB1 與 CDK1表達下調,PGCCs子代細胞中CyclinB1 與 CDK1表達則上調,這與流式細胞術結果相符合。

PGCCs的形成會發生去分化和向胚胎階段的逆轉[16]。PGCCs符合癌癥干細胞的定義,在調節人實體瘤細胞之間的異質性、干性和化學抗性中起著基本作用[17]。結果顯示,PGCCs及其子代細胞中腫瘤干細胞標志物CD44、ALDH1A1及CD133表達均上調。有研究應用流式細胞術分選出CD44+CD24-/low細胞亞群,并通過NOD/SCID小鼠成瘤實驗,確定了CD44/CD24是乳腺癌腫瘤干細胞表面標志物[18],但也有文獻報道CD24在乳腺癌MDA-MB-231細胞中不表達[19],因此在本研究中未進行CD24的相關實驗。應激壓力使細胞發生內復制或者細胞間的融合產生PGCCs,PGCCs在經歷G2/M周期阻滯后能夠產生具有治療抗性、惡性程度更高的子代細胞[20]。研究結果顯示,PGCCs子代細胞較MDA-MB-231細胞增殖、克隆形成能力均明顯增強。γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂(double-strand break,DSB) 的早期標志物,在無明顯DSB的情況下,γ-H2AX也與腫瘤的發生發展關系密切[21]。結果顯示,PGCCs子代細胞中γ-H2AX的表達較MDA-MB-231細胞上調。綜上結果表明,通過細胞內復制或者細胞間融合形成的PGCCs具有腫瘤干細胞特性,能夠通過不對稱分裂產生惡性程度更高的子代細胞,且PGCCs及其子代細胞與癌癥的發生發展密切相關。

目前研究認為,有絲分裂失敗是PGCCs形成的一個重要的原因[22],因此本研究探討了PGCCs及其子代細胞與BLM DNA解旋酶之間可能存在的關聯。本研究檢測了MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞中BLM、BRCA1及Rad51蛋白表達,結果顯示,PGCCs子代細胞較MDA-MB-231細胞BLM、BRCA1及Rad51蛋白表達均上調;隨后檢測了BLM DNA解旋酶特異性抑制劑ML216對PGCCs形成的影響,在PTX誘導MDA-MB-231細胞形成PGCCs的過程中加入ML216,結果顯示,ML216能夠抑制PGCCs的形成,使得PGCCs形成的數量明顯減少;體內實驗表明,PGCCs子代細胞的裸鼠成瘤能力較MDA-MB-231細胞明顯增強,腫瘤組織中BLM和Ki-67均呈高表達;本課題組前期研究表明,漢防己甲素衍生物HL-42和HL-49能夠抑制TNBC MDA-MB-231細胞增殖及誘導其凋亡[23]。在本研究中,以抑制BLM DNA解旋酶的酶活性為靶點對漢防己乙素衍生物進行篩選,通過熒光偏振實驗篩選出漢防己乙素衍生物LYY-47對BLM DNA 解旋酶的酶活性具有顯著的抑制作用,且 LYY-47能夠抑制MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞中BLM、Rad51及BRCA1蛋白的表達。

大量研究表明,細胞周期失調是惡性腫瘤細胞的重要特征之一,使得細胞具有無限增殖的能力,最終導致腫瘤的形成[24]。已有文獻報道,BLM DNA解旋酶與細胞周期具有重要關系,抑制BLM DNA解旋酶能夠有效提高PC3細胞在G0/G1期的細胞數量[8]。本研究檢測了LYY-47和ML216對MDA-MB-231和PGCCs子代細胞增殖和細胞周期的影響,設置了不同藥物濃度梯度作用于MDA-MB-231和PGCCs子代細胞,結果顯示LYY-47和ML216能夠濃度依賴地抑制MDA-MB-231和PGCCs子代細胞的增殖以及克隆形成;在此基礎上,采用流式細胞儀檢測了LYY-47和ML216對MDA-MB-231和PGCCs子代細胞周期的影響,結果顯示不同濃度的ML216能夠有效提高MDA-MB-231和PGCCs子代細胞G1期的細胞數量,G1期細胞數目增多,細胞難以進入S期,S期細胞減少,提示在ML216的干擾下,能夠抑制MDA-MB-231和PGCCs子代細胞的增殖;LYY-47可導致MDA-MB-231和PGCCs子代細胞S期細胞減少,G2/M期細胞明顯增加,細胞被阻滯于G2/M期,因此LYY-47可引起MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞G2/M期的阻滯,從而抑制細胞的增殖。進一步通過蛋白質印跡實驗檢測LYY-47對細胞周期G2/M期相關蛋白CDK1、CyclinB1表達的影響,結果顯示,LYY-47藥物處理組MDA-MB-231細胞和PGCCs子代細胞中CDK1、CyclinB1的表達均被顯著抑制了。同時也發現,相同濃度的情況下,LYY-47和ML216對MDA-MB-231細胞的增殖抑制以及克隆形成抑制要強于對PGCCs子代細胞,而對PGCCs子代細胞的周期影響則強于對MDA-MB-231細胞。

已有文獻報道,BLM DNA 解旋酶在DNA 損傷修復中起著重要作用[25]。本課題組前期研究表明,沉默BLM DNA解旋酶能夠導致DNA損傷增加,從而促進細胞的凋亡[26]。本研究中,使用不同濃度LYY-47處理MDA-MB-231和PGCCs子代細胞后,細胞凋亡率增加,Bax、cleaved Caspase-3及cleaved Caspase-8表達上調, Bcl-2表達下調,提示LYY-47能夠濃度依賴的誘導MDA-MB-231和PGCCs子代細胞發生凋亡。相同濃度的情況下,LYY-47對MDA-MB-231細胞的促凋亡作用要強于對PGCCs子代細胞,表明PGCCs子代細胞可能更具有藥物治療抗性。

綜上所述,本研究表明,BLM DNA 解旋酶可能參與了PGCCs的形成過程,LYY-47可通過抑制BLM DNA解旋酶誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期,從而影響PGCCs子代細胞的增殖。