電針對高脂誘導肥胖小鼠腸道菌群的影響

秦鴻宇,楊添淞,巴 特,孫忠人,馮楚文,張 淼,王玉琳△

1.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,黑龍江 哈爾濱 150001

肥胖(Obesity)是現代常見的慢性代謝性疾病,其為一種由多種原因引起的疾病,特征是體內脂肪含量高,能并發多種疾病。2020年發布的《中國居民營養與慢性病狀況報告》指出,中國18歲以上的成年人的超重率和肥胖率分別達到34.3%、16.4%[1]。肥胖與眾多慢性疾病有因果關系,其潛在的健康威脅很難估計,甚至被列為僅次于煙草和艾滋病的第三大健康殺手。肥胖已經嚴重影響人體的身心健康和生活質量。因此,預防和控制肥胖是21世紀世界各國共同面臨的重大公共衛生問題。

肥胖發病機制尚未完全明確,隨著人們對腸道菌群的認識加深,多種證據表明腸道微生態失調在肥胖和其他代謝性綜合征中起到關鍵作用。腸道菌群是一個復雜且多樣的腸道微生物系統。腸道菌群在人們出生后立刻達到一定較高的數量[2],并且隨著時間不斷的發展變化[3]。腸道菌群與宿主始終保持著互惠共生的關系[4-5]。有研究發現,肥胖之人腸道微生物的組成較正常人發生了巨大的改變。腸道微生物的種類和物種的比例與肥胖的發生密切相關。腸道菌群可以通過宿主與飲食之間的相互作用來調節免疫防御和能量代謝。本研究利用16S rRNA高通量測序技術,探究電針對肥胖小鼠的治療作用及腸道菌群機制的影響。為電針治療肥胖提供可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50只SPF級8周齡雄性C57BL/6J小鼠,購自遼寧長生生物技術有限公司,許可證號:SCXK(遼)2015-0001。本實驗經黑龍江中醫藥大學實驗動物使用與管理委員會批準(審批號:2019071502)。

1.1.2 主要試劑 4%多聚甲醛(武漢卡諾斯科技有限公司);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司);E.Z.N.A. Stool DNA Kit(Omega);Premix Taq(EX Taq Version 2.0 plus dye,TaKaRa);Phusion超保真DNA聚合酶(NEB公司);瓊脂糖(浩瑪生物);DL2000 DNA Marker(TaKaRa);DNA凝膠回收試劑盒(AxyPrepDNA)(AXYGEN公司);Tris HCl(南京翼飛雪生物科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器 一次性無菌針灸針(0.25 mm×13 mm,蘇州環球針灸醫療器械有限公司);G6805-2型電針儀(上海華誼醫用儀器有限公司);電子天平(德國Eppendorf公司);-80 ℃冰箱(MDF-382E,Panasonic);全自動生化分析儀(日立高科技貿易上海有限公司);超薄切片儀(德國LEICA公司);Leica顯微鏡(德國LEICA公司);超速冷凍離心機(H-2050R,湖南湘儀);微型離心機(北京六一),Baygene;電泳儀(北京六一);凝膠成像系統(北京六一);PCR儀(9700型,美國ABI公司);測序儀(美國Illumina公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與分組 50只C57BL/6J小鼠飼養于黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心,適應性喂養1周,自由進食飲水,12 h明暗周期、室溫20～24 ℃,相對濕度40%～60%。1周后,隨機篩選12只為空白組,飼以正常飲食,剩余38只飼以高脂飲食(高脂飼料購于派克生物技術有限公司)。高脂飼料配方詳見表1。飼養16周后,以高脂飲食小鼠體質量超過空白組平均體質量20%視為造模成功。造模成功率為63.2%,將造模成功的小鼠按隨機數字表法隨機分為模型組12只和電針組12只。

表1 高脂飼料配方 (%)

1.2.2 實驗干預方法 空白組:12只小鼠予正常飲食飼養,每天均要抓取并固定10 min,確保和電針組的小鼠飼養條件相同;模型組:12只小鼠予高脂飲食飼養,每天均要抓取并固定10 min,確保和電針組的小鼠飼養條件相同;電針組:12只小鼠予高脂飲食飼養,操作方法:將電針組小鼠進行捆綁并呈仰臥位固定在實驗板面上,用75%的消毒酒精對針刺穴位進行嚴格的消毒后,用0.22 mm×5 mm的毫針進行針刺治療,中脘穴:斜刺2 mm;天樞穴:直刺2 mm;足三里穴:直刺3 mm;三陰交穴:直刺1.5 mm。雙側天樞穴連接G6805-2型電針儀,頻率設置為30 Hz,強度調節為2～3 mA,采用疏密波,以針刺局部輕微抖動為度,每次留針10 min。1次/d,連續治療4周。

1.2.3 實驗樣本采集 實驗期間每周相同的時間用電子稱量并記錄每只小鼠的體質量。實驗結束后,所有小鼠禁食12 h,稱體質量。腹腔注射4%水合氯醛水溶液(10 mL/kg)麻醉小鼠。待小鼠完全麻醉用鑷子摘取小鼠眼球取血,取血后靜置1 h,用離心機離心,取血清。處死小鼠解剖后,剝離小鼠附睪脂肪組織,用生理鹽水進行沖洗,使用濾紙吸干水分后,進行稱重并記錄。并用4%多聚甲醛將組織進行固定。小鼠治療結束后用無菌棉簽輕輕按摩小鼠腹部促進其排便,用2 mL進口無菌凍存管收集糞便,每只小鼠接取約8粒糞便,暫時放入液氮中,等收集完樣本后放入-80 ℃冰箱保存,等待腸道菌群測序,1只小鼠未收集到糞便,故腸道測序共收集到35個樣本。

1.2.4 檢測血清脂質水平 取各組血清樣本,采用全自動生化分析儀測定各組小鼠血清中總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)以及低密度脂蛋白(Low density lipoprotein cholesterol,LDL)的含量。

1.2.5 HE染色 將固定好附睪脂肪組織,在50%、75%和95%的乙醇中進行梯度脫水;脫水后浸泡在二甲苯中,直至變得透明,然后進行石蠟包埋并切5 μm厚的片段;切片后的樣本進行脫蠟;脫蠟后將切片放入蘇木素染液中浸泡10 min,然后洗掉多余染料,于1%鹽酸酒精溶液中泡5 s,沖洗10 min后,去離子水洗2 min,最后把切片浸泡在伊紅染液中2 min;標本再進行梯度脫水并用二甲苯浸泡至透明;用中性樹膠封片;在光學顯微鏡鏡下觀察小鼠肝臟和附睪脂肪組織的形態變化。

1.2.6 16S rRNA高通量測序 經基因組DNA抽提、PCR擴增、熒光定量、文庫構建和Illumina PE250測序,通過Illumina PE250測序,能夠按照overlap關系對PE reads加以拼接,并對序列質量加以質控和篩選,以確保樣品的準確性。同時,通過對樣本開展OTU聚類分析以及物種分類分析,以獲得多種多樣性指數和測序深度檢測結果,而且能夠在不同分類水平上對群落結構開展統計分析。本研究使用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析。

2 結果

2.1 電針對各組小鼠體質量的影響

觀察各組小鼠治療前后的體質量。治療前,與空白組比較,模型組和電針組小鼠體質量均顯著升高(P<0.01)。治療結束后,空白組小鼠的體質量無明顯變化;與空白組比較,模型組小鼠體質量上升明顯(P<0.01);電針組小鼠體質量呈下降趨勢,且與模型組相比較,治療后電針組小鼠體質量明顯低于模型組,差異具有統計學意義(P<0.01),但電針組仍高于空白組。結果表明:電針能降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠的體質量。見表2。

表2 電針治療前后各組小鼠體質量比較

2.2 電針對各組小鼠附睪脂肪重量的影響

治療結束后,稱取3組小鼠的附睪脂肪重量發現,與空白組比較,模型組小鼠附睪脂肪量明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,電針組小鼠附睪脂肪量顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.01)。該研究結果表明,電針可以明顯降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠體內的脂肪含量。見表3。

表3 電針治療后各組小鼠附睪脂肪重量比較

2.3 電針對各組小鼠血脂的影響

檢測小鼠血清TC、TG及LDL水平,嚴格按照試劑盒說明進行檢測。結果顯示:與空白組比較,模型組的總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平的血清濃度增高(P<0.01);與模型組比較,電針組總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平明顯降低(P<0.01)。見表4。

表4 電針治療前后各組小鼠血脂的比較

2.4 HE染色觀察附睪白色脂肪

通過HE染色觀察3組小鼠的附睪脂肪組織形態的變化,與空白組比較,模型組肥胖小鼠的脂肪細胞體積明顯增大,脂肪細胞壁較薄,細胞間隙變大。與模型組比較,電針組小鼠的脂肪細胞體積明顯縮小,與空白組更加接近,細胞間隙變小。該研究結果說明電針可以明顯減少高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪的含量。見圖1。

圖1 各組小鼠附睪白色脂肪組織形態(HE 染色,200×)

2.5 測序深度和樣本多樣性分析

如圖2-A所示,隨著測序數據量的增加,觀測到的OTU數量也呈現出上升趨勢,但3組曲線逐漸變得平緩,這表明測序數據量合理,如圖2-B所示,Shannon-Wiener指數隨著測序數據量的增加而迅速達到穩定,表明測序數據量充足,能夠顯示出樣本中大部分的微生物信息。Rank-abundance曲線用來解釋物種豐度和物種均勻度。如圖2-C所示,曲線的寬度能夠顯示出物種的豐度,豐度越高代表水平軸上的曲線范圍也就越大;曲線的平滑程度顯示了樣本中物種的均勻度,曲線越平滑代表物種的分布也就越均勻。Specaccum物種累積曲線能夠用來判斷樣本量是否充足,也能夠用來估計物種的豐度。如圖2-D所示,隨著樣本量增加,可測到的OTU數量也會顯著上升,但當樣本量超過20時,曲線已變得平緩。說明該實驗的樣本量足夠大,能夠滿足持續抽樣的要求,從而可以進行數據分析。

注:A.各組小鼠腸道菌群樣品的稀釋性曲線;B.Shannon-Wiener曲線;C.Rank-abundance曲線;D.Specaccum物種累積曲線。圖2 測序深度和樣本多樣性分析

2.6 OTU分布Venn圖

根據物種注釋結果繪制Venn圖,利用不同的顏色和數字表示3組樣本間共有的和獨有的OTU數量。空白組、模型組與電針組的OTU數量分別為3 055個、1 790個和2 478個。結果中可以明顯地看出空白組的OTU數量遠遠超過模型組,說明高脂飲食顯著改變了小鼠的腸道菌群,降低了小鼠腸道菌群的物種多樣性。電針治療后,小鼠的腸道菌群多樣性明顯提高,但仍低于空白組。由此說明,電針治療可以有效改善肥胖小鼠的腸道微環境。見圖3。

圖3 各組OUT分布的Venn圖

2.7 群落結構組分圖

如圖4所示,在門分類水平上,3組小鼠主要由擬桿菌門(Bacteriodetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、彎曲桿菌門(Epsilonbacteraeota)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、髕骨細菌門(Patescibacteria)與疣微菌門(Verrucomicrobia)等組成,其中擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度比較高。

注:K代表空白對照組,A代表模型組,G代表電針組。圖4 門水平多樣本柱狀圖

研究結果顯示,空白組小鼠腸道菌群以擬桿菌門為主(占比為67.33%),厚壁菌門次之(占比為27.43%)。模型組小鼠腸道菌群則以厚壁菌門為主(占比為57.30%),而擬桿菌門豐度減少(占比為28.60%)。與模型組比較,電針組小鼠腸道菌群的擬桿菌門豐度增加(占比為38.73%),而厚壁菌門豐度減少(占比為50.20%)。在這3組中,空白組小鼠厚壁菌門豐度最低,模型組比空白組小鼠的厚壁菌門豐度顯著升高,電針組比模型組降低。空白組小鼠擬桿菌門是豐度最高,模型組與空白組比較,擬桿菌門豐度顯著下降,電針組比模型組上升。為了評估厚壁菌門和擬桿菌門在治療肥胖中的作用,本研究計算了兩者的比值。厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)這一比值因高脂飲食而升高,空白組F/B比值為0.41,模型組F/B比值為2,電針組F/B比值為1.3。說明電針對降低厚壁菌門比例及提高擬桿菌門比例有顯著的效果。

如圖5所示,在屬分類水平上,空白組中Muriba-culaceae_norank占比最高(54.04%),其次為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)(6.96%)、毛螺菌科NK4A136(Lachnospiraceae NK4A136 group)(5.71%)、擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)(5.57%)、毛螺菌科未培養屬(Lachnospiraceae_uncultured)(3.27%)、普雷沃菌科UCG-001(Prevotellaceae UCG-001)(1.72%)、瘤胃球菌未培養屬(Ruminococcaceae_uncultured)(1.65%)、擬桿菌屬(Bacteroides)(1.23%)、另枝菌屬(Alistipes)(1.05%)與脫硫弧菌科未培養屬(Desulfovibrionaceae_uncultured)(0.97%)等。在模型組中,屬水平上豐度最高的菌為Muribaculaceae_norank(12.65%)。其次為乳酸桿菌屬(8.59%)、羅氏菌屬(Roseburia)(8.16%)、毛螺菌科未培養屬(7.54%)、脫硫弧菌科未培養屬(7.20%)、Odoribacter(6.06%)、毛螺菌科NK4A136(4.57%)、瘤胃梭菌9(Ruminiclostridium 9)(4.41%)、瘤胃梭菌(4.12%)與瘤胃球菌未培養屬(3.89%)等。在電針組中,屬水平上豐度最高的菌為Muribaculaceae_norank(30.74%)。其次為乳酸桿菌屬(27.03%)、毛螺菌科NK4A136(4.18%)、糞桿菌(3.84%)、瘤胃球菌 UCG-014(2.71%)、擬普雷沃氏菌屬(2.47%)、螺桿菌屬(2.46%)、雙歧桿菌屬(1.92%)、Mucispirillum(1.91%)與瘤胃球菌未培養屬(1.60%)等。

注:K代表空白對照組,A代表模型組,G代表電針組。圖5 屬水平多樣本柱狀圖

由上述結果從屬水平來看,空白組中主要菌群為擬桿菌門的Muribaculaceae_norank,占比達到54.04%,而模型組中Muribaculaceae _norank占比顯著下降(12.65%),電針干預后,Muribaculaceae_norank占比明顯上升(30.74%)。結果說明電針干預后腸道菌群發生了明顯的變化。

3 討論

根據中醫理論,肥胖屬于“臟腑病”的范疇,病位多責之于脾胃,故而肥胖的辨證多為脾胃相關的證候。人的生命活動深受氣機升降轉化的影響,脾胃直接參與了氣的生成和氣化的過程。脾主運化,位居中焦,為后天之本,是津液輸布的樞紐,脾胃功能正常,機體才能得到后天的水谷精氣充養而正常勞作生息,若脾氣虛弱,就會失去其“游溢精氣”“散精”功能,不能運輸和布散水谷精微及運化水濕,導致濕濁內生形成痰,痰濕積聚在機體內,進而形成肥胖。《河間六書·濕類》也論述了胖人多濕,進一步說明了脾虛生濕與肥胖之間的關系。故而針灸減肥多以脾胃經腧穴為主。

本研究選取天樞穴(雙側)、足三里(雙側)與三陰交(雙側)。天樞穴是足陽明胃經腧穴,是大腸募穴,主通調腸腑、理氣行滯。可調節胃腸道功能,調暢氣機,有促進新陳代謝等作用。針刺天樞穴亦能夠促進腸道的運動,幫助分解腹部的脂肪。有研究表明,天樞穴進行埋線治療能夠有效的減輕體質量與體脂,增強胰島素的生理效應,改善肥胖患者胰島素抵抗,具有顯著的降脂、減脂的作用,對于防治肥胖及其并發癥有較好的臨床效果[6]。足三里屬于胃經腧穴,胃經合穴、胃經下合穴,治療脾胃疾病常選用足三里穴。肥胖之人的脾胃功能紊亂,足三里有健脾和胃、利濕化痰的功效。針刺該穴能夠調節脾胃的功能,使饑餓中樞興奮性大大降低,從而降低患者的食欲并促進腸道運動,達到減肥的目的。三陰交穴屬于足太陰脾經,也是脾經、腎經與肝經的交會穴,一穴通三經,三經連三臟。脾的升清功能與肝主疏泄的關系密切相關,腎主封藏、司二便,與新陳代謝密切相關。因此,針刺天樞、足三里與三陰交穴,共同作用,起到了調理氣血、調暢氣機、健脾和胃與祛濕化痰等減肥的作用。

盡管之前的研究結果已經證實電針可以改善單純性肥胖[7-8]。但確切的作用機制尚未完全清楚。隨著研究的深入,越來越多的證據指出腸道菌群在肥胖、胰島素抵抗等代謝性疾患的發生和發展中起到至關重要的作用[9-10]。腸道微生物群的組成與肥胖發生之間的密切相關。人類腸道中擁有1 000多種細菌,細胞總數達1013～1014[11]。人體的腸道中蘊含著豐富的微生物,其中擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門數量最為豐富,它們共占腸道微生物群落的約90%。其中,主要門類的厚壁菌門(Firmicutes)/擬桿菌門(Bacteroidetes)的增加比率和變化可以促進肥胖小鼠膳食和遺傳模型的肥胖發展[12-13]。Ley等[14]首先證實了肥胖與腸道菌群相聯系,肥胖小鼠與瘦小鼠比較,肥胖小鼠腸道菌群中的擬桿菌門少、厚壁菌門多。Turnbaugh 等[12]計算了肥胖小鼠和非肥胖小鼠中的9個細菌門類的相對豐度,結果發現與正常小鼠相比較,肥胖小鼠的擬桿菌門/厚壁菌門比例較低。同時,還對多形擬桿菌和直腸真桿菌的基因組進行了對比,進一步證明了肥胖小鼠的腸道菌群中厚壁菌門的豐度較高。擬桿菌和真桿菌分別代表了擬桿菌門和厚壁菌門。正常小鼠盲腸中真桿菌與擬桿菌的同源染色體序列的比值為1.5,而肥胖小鼠中二者的比值高達7.3,更能夠證明厚壁菌門與擬桿菌門的比例與肥胖的關系。腸道菌群通過增加小腸絨毛毛細血管的密度,影響腸道生理和運動,從而影響腸上皮的發育,進而促進飲食中的熱量攝取[15]。針灸可以改變腸道微生物的種類和數量,并且具有良性調節腸道微生態平衡的作用,研究發現[16],針灸可以增加腸道菌群的多樣性和有益菌的數量,減少有害菌的數量,維持腸道微生物的平衡,針刺可以通過腦-腸軸來調節腸道菌群。腦-腸軸是大腦通過中樞神經系統、腸神經系統等與腸道形成的雙向交通的神經-內分泌-免疫網絡系統。腸道菌群通過腦-腸軸介導的神經遞質與免疫信息等,參與腸道功能的調節。針刺可以通過介導腦-腸軸的各個環節實現調節腸道菌群的作用。腦腸肽存在于腦腸中,是一種神經活性肽,廣泛參與腸道運動、神經遞質與免疫因子的分泌和調節。針刺可以激活和釋放腦腸肽,從而達到調控胃腸運動和腸道菌群的目的,起到減肥的作用。

本實驗研究利用16S rDNA測序技術對空白組、模型組與電針組小鼠糞便樣本進行了分析。發現由于高脂飲食的攝入,引起小鼠腸道菌群結構和功能改變,通過電針進行干預后,肥胖小鼠腸道菌群紊亂得到一定程度的恢復。因此,可以推測,電針可以通過調節腸道菌群的結構和功能從而減少肥胖小鼠體質量。但本研究樣本量較小,電針治療的時間有限,仍需進一步大樣本量的實驗研究,完善實驗方案的相關觀察指標,更好地為臨床治療肥胖提供依據。