電針對反復丙泊酚暴露大鼠炎癥反應的影響

王喜軍,高 寧,范舜欽

1.廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院,廣西 南寧 530201;2.廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530200

丙泊酚作為一種靜脈麻醉藥,具有誘導時間短、起效快、恢復時間短和降低腦氧耗等[1]優點,是一種臨床常用的靜脈全麻藥物,通常用于小兒麻醉的誘導和維持,已經在臨床工作中被廣泛使用。有研究表明,單次接觸丙泊酚麻醉對新生大鼠大腦神經發育無明顯影響,且能夠緩解手術創傷所造成的幼鼠中樞炎癥反應[2-3]。但反復接受丙泊酚麻醉可引起中樞炎癥介質釋放增多,產生神經炎癥反應,由此產生的神經回路結構改變可導致神經功能認知障礙[4],術后對患者的生活造成不良影響。針灸“治未病”已有悠久的歷史,可激發人體內的正氣,增強抗病能力,防止疾病的發生發展[5]。電針是傳統針灸與現代電刺激相結合的產物,它是指在毫米針具上接通與人體生物電相似的脈沖電流,利用針、電雙重刺激,調節經絡之氣以達到防止疾病的目的[6]。2003年,動物實驗首次證實重復電針刺激百會穴可以減輕腦缺血后神經受損程度,發揮腦保護效應[7]。目前已有研究表明,電針能夠降低腦缺血再灌注損傷大鼠模型腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6的表達[8]。電針大椎、百會減輕神經炎癥的效果明顯[9-10]。因此,本研究觀察電針干預對反復丙泊酚暴露大鼠炎癥反應的影響,以期為臨床麻醉后的重要器官功能保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

10日齡健康SD大鼠40只(雌雄各半,體質量26～28 g)購自廣西醫科大學實驗動物中心(實驗動物許可證號:SCXK[桂]2014-0002)。實驗動物于普通動物房飼養,溫度24 ℃,相對濕度60%～70%。每天8:00—20:00日光燈照明,模擬12 h/12 h的白晝比例。本研究所有動物實驗取得了廣西中醫藥大學倫理委員會的許可(審批號:DW20230313-036)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 丙泊酚注射液(四川國瑞,批號:22120212);兔抗IL-6(1:1 000,A0286,Servicebio,China);兔抗TNF-α(1:1000,A0277,Servicebio,China);兔抗β-actin(1:1000,GB11001,Servicebio,China);兔抗HMGB1(1:1000,GB11103,Servicebio,China);兔抗Iba-1(1:1 000,GB11105,Servicebio,China)。

1.2.2 儀器 一次性無菌針灸針(華佗牌);SDZ-Ⅱ華佗牌電針儀(蘇州醫療用品有限公司)。

1.3 分組與干預方法

采用隨機數字表法將其分為5組(每組8只):生理鹽水對照(C)組,腹腔注射生理鹽水100 μL;脂肪乳劑(F)組,腹腔注射脂肪乳劑100 μL;電針(E)組,選取大鼠“百會穴”“大椎穴”進行電針刺激;丙泊酚(P)組,腹腔注射異丙酚100 mg/kg;電針+丙泊酚(EP)組,先給予丙泊酚(同P組),后電針干預(同E組)。

1.3.1 電針方法 電針的穴位選取百會穴(頂骨正中、兩耳連線中點),大椎穴(第7頸椎與第1胸椎間、背部正中);根據中國針灸學會實驗針灸研究會制定的大鼠穴位定位方法[11]進行定位。將一次性無菌針灸針平刺入百會穴2 mm,斜刺入大椎穴3 mm,通過連接電針儀,疏密波,頻率2 Hz/10 Hz,刺激強度以大鼠針刺部位皮膚微顫為宜,1次/d,每次持續30 min,連續干預3 d。

1.3.2 反復丙泊酚暴露模型 首次腹腔注射丙泊酚50 mg/kg,待大鼠翻正反射恢復后,再追加丙泊酚50 mg/kg,連續給藥5 d。

1.4 取材

造模完成后進行取材,對大鼠充分麻醉后,立即于冰面上斷頭取海馬組織。用冰的生理鹽水和冰的多聚甲醛溶液依次進行灌流,腦組織充分固定后,用解剖器械鈍性剝離顱骨,快速取出整個腦組織于多聚甲醛溶液中固定備用。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 免疫熒光染色檢測海馬組織中Iba-1、HMGB1的表達量 將每組腦組織切片進行脫蠟、復水后進行抗原修復等操作,隨后孵育一抗:封閉完成后,取出腦組織切片,倒去封閉液,將稀釋好的一抗工作液滴加在腦切片表面,置于濕盒中4 ℃孵育過夜。孵育二抗:一抗孵育完畢后,充分清洗再滴加熒光二抗工作液于腦切片表面,放入濕盒內,置于37 ℃恒溫箱內孵育1 h。最后封片和觀察,每組選取3個視野進行拍照。

1.5.2 Western blot法檢測海馬組織中TNF-α、IL-6表達量 加入適量蛋白樣品和Marker,上樣完成后,設定90 V恒壓,開始電泳,觀察到藍色蛋白樣品位于分離膠和濃縮膠交界位置,Marker分離成多條清晰的直線時,調整電壓為120 V,繼續電泳,直至溴酚藍指示劑到達凝膠下緣時,可以終止電泳。轉膜:設置快轉電流為0.4 A,時間為15 min。封閉:快轉完畢后將PVDF膜取出,5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。孵一抗:封閉完畢后將PVDF膜用TBST溶液洗3次,每次10 min,然后浸泡在一抗工作液中,放在搖床均勻搖晃,4 ℃過夜。敷二抗:將孵育好一抗的PVDF膜取出,TBST洗3次,每次10 min,然后浸泡在二抗工作液中常溫孵育1 h。顯影與結果分析:利用化學發光進行顯影,使用ImageJ軟件對蛋白條帶進行結果分析,以β-actin為內參,以目標蛋白與內參蛋白灰度值的比值作為TNF-α、IL-6相對表達量。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組海馬組織小膠質細胞活化情況比較

Iba-1是小膠質細胞活化的主要標志物。與C組比較,P組海馬小膠質細胞Iba-1累積熒光強度明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05),提示小膠質細胞激活明顯增多;丙泊酚注射液的主要成分是脂肪乳劑和2,6-二異丙基苯酚,故設脂肪乳劑組(F組)以排除脂肪乳劑對實驗結果的干擾。與C組比較,F組海馬小膠質細胞Iba-1累積熒光強度差異無統計學意義(P>0.05),提示丙泊酚注射液中的脂肪乳劑成分對本實驗結果無影響。與C組比較,E組海馬小膠質細胞Iba-1累積熒光強度比較差異無統計學意義(P>0.05),提示電針對健康新生大鼠海馬區無影響。與P組比較,EP組海馬Iba-1累積熒光強度下降,差異具有統計學意義(P<0.05),提示電針能抑制海馬小膠質細胞的激活。見圖1、表1。

表1 各組新生大鼠海馬區Iba-1累積熒光強度比較

注:免疫熒光檢測各組海馬Iba-1表達;紅色為Iba-1,A標尺=100 μm,B標尺=50 μm。圖1 電針對新生大鼠海馬區小膠質細胞活化的影響

2.2 各組海馬組織中HMGB1的表達情況比較

與C組比較,P組海馬區HMGB1累積熒光強度明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。與P組比較,EP組海馬區HMGB1累積熒光強度下降,差異具有統計學意義(P<0.05),提示電針能抑制海馬區HMGB1的表達。C組與F組、E組的差異比較無統計學意義。見圖2、表2。

表2 各組新生大鼠海馬區HMGB1累積熒光強度比較

注:紅色為Iba-1,綠色為HMGB1, 藍色為DAPI標記細胞核。 圖2 電針對新生大鼠海馬區HMGB1表達的影響

2.3 各組海馬組織中TNF-α、IL-6表達量比較

與C組比較,P組海馬組織中TNF-α、IL-6表達量升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。與P組比較,EP組海馬組織中TNF-α、IL-6表達量降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。E組和EP組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表3。

表3 各組新生大鼠海馬區TNF-α、IL-6表達含量比較

圖3 電針對新生大鼠海馬區炎癥因子TNF-α、IL-6表達的影響

3 討論

中醫對“炎癥”并無明確的概念[12]。漢字“炎”是二火重疊,根據中醫理論中“取類比象”“推絡演繹”的思維,火熱之性燔灼,一般將“炎癥”歸于熱證、實證病機范疇,通常治法為清熱瀉火,但臨床效果不佳。電針作為近年來新興的治療手段,在臨床上已有一定的效果。百會穴位于督脈,有通督調神、醒腦開竅之效[13]。有研究表明[14-16],針刺百會、大椎穴能夠顯著降低腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)模型大鼠大腦的炎癥反應,保護腦功能。故本實驗選取百會和大椎穴進行電針干預。海馬組織對于炎癥反應極為敏感[17],在研究丙泊酚麻醉誘導的腦功能障礙中,研究者[18-19]一般通過海馬組織觀察中樞神經炎癥反應。

在實驗大鼠日齡的選擇上,根據既往研究選擇10日齡SD大鼠作為研究對象[20-21]。嬰幼兒應用麻醉藥物是否對發育期大腦產生影響一直是醫學界存在爭議的話題。Li Y等[22]的研究表明新生大鼠接受局麻手術和多次丙泊酚麻醉可在建模1 d后引起中樞炎癥介質釋放增多,海馬組織中TNF-α濃度增加,天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶(Cysteine-containing aspartate-specific protease,Caspase)-3和原癌蛋白Fos(oncogene Fos,c-Fos)表達增多。

本研究顯示反復丙泊酚暴露在短期內使新生大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6表達明顯升高,加重神經炎癥反應,與Cui Y等[23]的研究結果一致,即長時間、反復丙泊酚刺激可加重大腦神經炎癥反應,而電針干預后海馬組織中TNF-α、IL-6表達量較單純丙泊酚組(P組)明顯降低。既往臨床試驗研究[24]也表明電針督脈穴能夠降低腦梗死恢復期患者炎癥因子TNF-α、IL-1β水平,促進神經功能的恢復。

Iba-1是小膠質細胞活化的主要標志物,其表達量反映了小膠質細胞的活化程度[25]。小膠質細胞是中樞神經系統的巨噬細胞,主要生理功能包括免疫監視、吞噬異常細胞,調節神經元活動,調節突觸可塑性[26]。同時,小膠質細胞能夠對傷害性刺激做出反應[27]。當中樞神經系統產生創傷、缺血缺氧和神經退行性改變等病理損傷時,小膠質細胞可轉變為M1、M2兩種活化類型,M1型通過分泌蛋白酶、炎癥因子等加劇炎癥反應,誘導炎癥細胞遷移至受損區域,而M2型可分泌抗炎因子從而減輕炎癥反應[28]。Deng P等[29]發現電針干預能夠抑制腦缺血誘導的小膠質細胞活化。劉欣媛等[30]的研究表明電針百會、腎俞穴能夠抑制7月齡SAMP8小鼠海馬的炎癥反應,減少炎癥因子的分泌,抑制小膠質細胞激活,有腦保護作用。本研究結果顯示,與造模組(P組)比較,電針處理組(EP組)海馬區小膠質細胞中Iba-1水平降低,且炎癥因子TNF-α、IL-6表達降低,提示電針可能通過下調Iba-1表達水平,抑制小膠質細胞向M1型活化,從而減輕反復丙泊酚暴露大鼠的神經炎癥反應。

HMGB1是一種典型的損傷相關分子模式蛋白[31],廣泛存在于哺乳動物細胞核中,在大腦中由小膠質細胞主動分泌或受損、死亡的細胞被動分泌,作為細胞外信號分子促進免疫細胞向病變部位遷移產生炎癥反應,調控氧化應激、炎癥聯級反應[32],同時也是細胞壞死性凋亡釋放的關鍵因子[33]。有研究表明[34]在術后認知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)模型中,小鼠海馬細胞釋放的HMGB1可增加Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)2的表達,進而導致中樞神經炎癥反應。本研究結果表明,反復丙泊酚暴露的新生大鼠通過電針干預后,海馬小膠質細胞HMGB1表達水平降低,同時炎癥因子TNF-α、IL-6表達量下降,提示電針減輕反復丙泊酚暴露神經炎癥的部分機制可能是抑制小膠質細胞HMGB1表達、減少小膠質細胞壞死性凋亡的數量。

綜上所述,電針能有效抑制反復丙泊酚暴露大鼠的神經炎癥反應,其機制可能與下調細胞因子Iba-1、HMGB1的表達水平、抑制小膠質細胞的過度活化和壞死性凋亡有關。