血清IL-33和TNF-α活性及外周血淋巴細胞中NF-κB水平與冠心病不同程度病變的相關性分析

鮮 維,譚 鑫,耿嘉逸,鄒仕英,楊海晨,康品方,3,張 恒

(1.蚌埠醫科大學第一附屬醫院 心血管內科,安徽 蚌埠 233004;蚌埠醫科大學2.公共衛生學院,3.心腦血管病研究中心,安徽 蚌埠 233030)

目前心血管系統疾病已成為城鄉居民總死亡因素的首要位置,其中冠心病(coronary heart disease,CHD)是心血管系統中最常見且致死率最高的疾病。CHD是一種位于冠狀動脈(冠脈)壁上的以炎癥和斑塊積累為特征的疾病,這些斑塊主要由脂質、鈣和炎性細胞組成,并且這些病理改變最終可導致冠脈狹窄乃至供血不足而引起心肌功能障礙甚至死亡[1-4]。盡管已經發現了許多危險因素,如不良飲食、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥、肥胖等,CHD的病因和發病機制仍然尚未完全了解[5-6]。

白細胞介素-33(IL-33)是近年來發現的IL-1細胞因子家族的新成員,具有生物活性,可與靶細胞膜上的生長刺激表達基因2蛋白(ST2)結合形成跨膜復合體,形成IL-33/ST2信號通路,參與Th2活化相關的多種疾病發生與進展[7-9]。IL-33表達于多種組織器官中,而主要表達IL-33的是人類不同器官和組織中的各種內皮細胞,此外,在其他類型細胞,如上皮細胞、平滑肌細胞和纖維母細胞等也有IL-33的表達[10]。目前有研究[11]表明血清IL-33與CHD的發展存在一定的聯系。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)是一個至少由19種細胞因子組成的肽介質家族的成員,具有重要的促炎特性,在先天和適應性免疫、細胞增殖和凋亡過程中發揮關鍵作用[12]。有研究[13]表明TNF-α在動脈粥樣硬化的病理進展中發揮著極為重要的作用,它可以通過促進內皮細胞黏附分子的表達,招募和激活炎癥細胞,啟動動脈壁內的炎性反應。核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)家族轉錄因子在細胞環境中作為應激源發揮重要作用,并控制重要調控基因的表達,如免疫、炎癥、死亡和細胞增殖。NF-κB蛋白位于細胞質中,可被各種細胞刺激激活[14-15]。

目前,IL-33和TNF-α在CHD中的具體致病機制尚不明確,血清中IL-33和TNF-α水平與CHD的相關性也仍待繼續研究,本研究擬檢測不同病變程度CHD病人血清中IL-33和TNF-α活性水平,明確CHD病人病變程度與IL-33和TNF-α活性水平之間的關系以及外周血淋巴細胞中NF-κB蛋白水平變化在其中的關系,為CHD的臨床診療提供一些新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2019年1月至2020年6月蚌埠醫科大學第一附屬醫院心內科確診患有CHD的病人共167例,男98例,女69例,年齡(64.05±10.218)歲。所有病人均通過常規12導聯心電圖或Holter、心臟彩超和冠脈造影等檢查明確病情。所有病人收治入院后及時采血完成血常規、生化常規檢查并記錄血壓和體質量指數。CHD病人按照冠脈造影中記錄的冠脈各支病變情況,依據Gensini評分[16]將病人分為:輕度病變組(<30分,LS組)84例,中度病變組(30～<60分,MS組)54例,重度病變組(≥60分,HS組)29例。其中有CHD發作癥狀但行冠脈造影未見明顯異常者作為對照組(CON組)共27例。4組一般資料差異均無統計學意義(P>0.05)(見表1),具有可比性。

表1 4組病人入院時基線資料比較

1.2 入選標準

納入標準:(1)無嚴重精神系統疾病者;(2)病人及其家屬均知曉并自愿接受;(3)有正常認知、書寫、溝通能力者。排除標準:既往有心臟瓣膜病、心肌病、急性心肌炎病人,既往有惡性腫瘤、風濕免疫系統疾病或內分泌及代謝性疾病、免疫功能低下、患有神經系統退行性改變疾病、心房顫動及感染性疾病病人[17],不能配合治療或中途退出者。

1.3 一般資料收集

記錄病人的姓名、性別、年齡等基礎信息,吸煙飲酒史等一般信息,有無高血壓、糖尿病、肝炎等慢性病病史,以及血細胞計數[紅細胞、白細胞、血小板、中性粒細胞]、總膽紅素、膽固醇及三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、總蛋白、C反應蛋白(CRP)、B型腦鈉肽(BNP)等相關指標。

1.4 標本采集

收集入院后24 h內肘靜脈血(禁食12 h后)5 mL于肝素抗凝試管中,4 ℃,3 000 r/min,5 min離心,吸取上層血清,-80 ℃冰箱中備用;將剩余試管中液體轉移至15 mL離心管中,加入等體積PBS混勻后,緩慢加入淋巴細胞分離液,4 ℃,2 000 r/min,20 min離心;緩慢吸出中間白色薄膜狀淋巴細胞;加5倍以上體積的PBS洗2次,每次離心1 500 r/min,10 min;細胞沉淀用凍存液保存至液氮中備用。

1.5 血清IL-33和TNF-α活性檢測

標本徹底融化后,采用ELISA法,使用上海羽朵生物科技有限公司的人IL-33和TNF-α ELISA試劑盒,分別檢測IL-33和TNF-α的吸光度值并計算濃度。

1.6 Western blotting檢測NF-κB蛋白表達

嚴格按照說明書步驟提取外周血淋巴細胞,在提取的細胞中加入適量RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),冰上裂解30 min,4 ℃,12 000 r/min,10 min離心;取出上層蛋白懸液使用蛋白定量試劑盒(碧云天)進行定量;擬定每孔30 μg進行SDS-PAGE電泳,用PVDF膜4 ℃進行轉膜,5%脫脂奶粉封閉后,4 ℃孵育一抗過夜,TBST洗膜4次,每次5 min;室溫孵育二抗90 min,洗膜3次,每次10 min,應用ECL進行曝光顯影。

1.7 統計學方法

采用t檢驗、方差分析、q檢驗、χ2檢驗和χ2分割檢驗。

2 結果

2.1 CHD不同樣本的臨床指標分析

各組間TG、總蛋白、HDL及低密度脂蛋白(LDL)、WBC、淋巴/單核細胞差異均無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 各組病人生化指標及血細胞計數比較

分組n紅細胞/(×109)總膽紅素/μmol/L CR/(μmol/L)CRP/(mg/L)BNP/(pg/mL)CON組274.35±0.4312.01±8.362.41±17.55.81±7.01271±697.65LS組844.37±0.4011.04±5.068.18±21.65.08±10.71315±957.28MS組544.43±0.519.95±3.867.29±16.74.37±7.21338±610.86HS組294.35±0.4310.14±4.171.83±17.94.17±4.09380±640.12F—0.581.171.150.250.04P—>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05MS組內— 0.19727.106370.87173.1832 144.410

2.2 血清IL-33和TNF-α活性水平比較

HS組血清IL-33水平較LS組CON組升高(P<0.05),且隨著冠脈病變嚴重程度加重其含量逐漸升高;血清TNF-α水平也隨著冠脈病變嚴重程度的加重而逐漸升高(P<0.01),且兩者之間呈正相關關系(r=0.663,P<0.01)(見表3)。

表3 血清IL-33和TNF-α活性水平在CHD中的變化

2.3 外周血淋巴細胞中NF-κB蛋白的表達

Western blotting結果顯示,與CON組(0.57±0.09)相比,CHD組(0.96±0.05)外周血淋巴細胞中NF-κB蛋白表達增加,差異有統計學意義(t=4.85,P<0.01)(見圖1)。

3 討論

《中國心血管健康與疾病報告2019》指出,中國的心血管疾病患病率和死亡率仍處于上升趨勢[8]。據估計,我國現患的心血管疾病人數大約為3.3億人,其中CHD是心血管疾病中的常見病,患病人數高達1 100萬[18],因此,尋找相關的發病機制對CHD的早期預防具有及其重要的意義。

有研究[19]發現根據不同來源信號刺激,IL-33呈現出的促炎或抗炎作用主要具有兩種作用模式,一種是作為細胞因子或警示信號的胞外作用模式,另一種是作為轉錄調節因子的胞內作用模式。還有研究[20]發現IL-33/ST2通路在急性冠脈綜合征病人心肌炎性反應進程發揮重要作用,同時該通道與此類病人的遠期心肌梗死以及心力衰竭等預后密切相關。SCHMITZ等[21-22]報道IL-33可以激活內皮細胞、促進炎癥的發生,同時又可以誘導人的內皮細胞向炎癥表型轉化,具有顯著的促炎、促血栓形成作用,并且在冠脈的斑塊處呈高表達狀態,它的水平與斑塊破裂后不良心血管事件具有緊密的臨床聯系。同時,MCLAREN等[23]實驗發現IL-33還可以通過降低與膽固醇攝取相關的關鍵基因mRNA表達和增加與膽固醇流出相關的基因表達來減少巨噬細胞泡沫細胞的形成。IL-33在CHD的發生、發展過程中起著的保護作用。在CHD的發生發展過程中,隨著冠脈粥樣斑塊的病變以及狹窄的加重,CHD病人的IL-33水平也隨之升高,這可能與病變區域的炎癥反應激活、凋亡等機制反應性激活有關,并且隨著冠脈病變程度的加重,其炎癥狀態也加重,凋亡激活等造成的抑制性反饋機制促進IL-33的表達,抑制病變的進一步加重,反映了機體在炎癥狀態下的自我保護及代償機制[24-25]。本研究發現,與CON組相比,IL-33的水平隨著冠脈病變的嚴重程度與病變支數的增加而升高,提示了IL-33可能在CHD 的發生發展中發揮了重要的作用。

TNF-α是炎癥反應的主要啟動因子之一,是損傷等炎性反應時由巨噬細胞、單核細胞、平滑肌細胞、內皮細胞等分泌的多肽類物質,在炎癥和代謝中起著重要的作用[26-27]。TNF-α可以通過促進內皮細胞黏附分子的表達,招募和激活炎癥細胞,啟動動脈壁內的炎癥級聯,同時它也可以調控血管壁細胞的增殖、壞死和凋亡,促進細胞外基質與血管活性物質的合成、分泌,導致脂代謝異常,進而在CHD的血管損傷和心肌缺血中起著重要作用[28-29]。在本研究中,我們發現隨著CHD的病變嚴重程度的增加,血清TNF-α水平也隨之而升高。

NF-κB蛋白可以調節數百個基因的表達,這些基因調控著重要的生理過程,如炎癥、免疫、增殖和細胞死亡。由于NF-κB的活性是由許多不同的刺激自發調節的,NF-κB蛋白可以被認為是細胞穩態的調節器[14-15,30]。有研究[31]顯示,NF-κB能夠通過調控TNF-α從而改變人支氣管上皮細胞的炎癥狀態以及細胞增殖。HELBIG等[32]研究發現,在小鼠骨髓源性樹突狀細胞中,IL-33可能通過MyD88-IKK2-NF-κB、p38-MK2/3等信號通路,誘導TNF-α的產生。本次研究中發現在CHD病人的外周血淋巴細胞中,NF-κB的表達較冠脈正常者顯著增高,同時通過Pearson相關分析發現,IL-33的變化與TNF-α水平呈正相關關系,因此我們推測,IL-33可能與TNF-α相互作用,并通過調控NF-κB的表達參與了CHD的發生、發展。

綜上所述,我們觀察到IL-33和TNF-α活性水平隨著冠脈粥樣硬化的病變程度加重而升高,且兩者含量變化呈正相關關系,同時外周血淋巴細胞中的NF-κB蛋白可能在CHD的發展中發揮著重要作用,但其中的相關機制尚不明確,仍有待于進一步的研究證實。同時,它們提供了一個可能判斷CHD嚴重程度的指標,并可能促使未來的研究探討IL-33和TNF-α在CHD病人急性冠脈事件風險中的治療作用。