SIRT2在小鼠1-細(xì)胞期受精卵中的表達(dá)和定位研究

莊 妍,任麗芳,韓 迪,孟 峻

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

細(xì)胞周期是產(chǎn)生細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)的基本過程,主要包括間期1(G1)、DNA合成期(S)、間期2(G2)和有絲分裂期(M)。深入研究細(xì)胞周期機(jī)制不僅能夠輔助體外受精(invitrofertilization,IVF)進(jìn)展,還有助于逆轉(zhuǎn)癌癥代謝和恢復(fù)癌癥的免疫監(jiān)視[1-2],小鼠卵母細(xì)胞和受精卵細(xì)胞往往作為觀察細(xì)胞周期的良好模型。近年來,MAHDESSIAN等[3]使用熒光泛素化細(xì)胞周期指標(biāo)(FUCCI)技術(shù),通過在單個(gè)細(xì)胞水平上對細(xì)胞周期中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行精確的人類蛋白質(zhì)組學(xué)綜合圖譜分析,進(jìn)一步驗(yàn)證了大多數(shù)細(xì)胞周期蛋白的翻譯后調(diào)節(jié)是推動(dòng)細(xì)胞周期循環(huán)的關(guān)鍵因素。

沉默信息調(diào)節(jié)蛋白(Sirtuins)是一類煙酰胺腺嘌呤二核甘酸(NAD+)依賴性酶,通過多個(gè)下游靶標(biāo)的去乙酰化和其他翻譯后修飾影響不同的細(xì)胞發(fā)育過程,包括轉(zhuǎn)錄沉默、DNA重組和修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞代謝[4]。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)和酶活性的差異,人源Sirtuin蛋白可分為1～7種亞型,其中SIRT2是唯一定位于細(xì)胞質(zhì),且具有強(qiáng)NAD+依賴脫乙酰基酶活性的Sirtuin亞型[5],SIRT2的乙酰化調(diào)節(jié)是細(xì)胞周期進(jìn)程的重要影響因素。SIRT2是主要的組蛋白去乙酰化酶,維持核小體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和正常組裝,保證機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)和DNA正常轉(zhuǎn)錄[6]。在細(xì)胞正常分裂過程中,微管蛋白的NAD依賴性乙酰化由SIRT2介導(dǎo)。在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中,RASSF1A調(diào)節(jié)SIRT2和HDAC6介導(dǎo)的微管蛋白乙酰化以形成正常形態(tài)的紡錘體,確保染色體的正常排列[7]。由此筆者認(rèn)為SIRT2在細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。然而關(guān)于SIRT2蛋白在小鼠受精卵發(fā)育中的表達(dá)與定位情況尚鮮見報(bào)道,因此本課題組以小鼠1-細(xì)胞期受精卵為模型,采用qRT-PCR和Western blotting技術(shù)分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測SIRT2在小鼠1-細(xì)胞期受精卵G1、S、G2和M四期中的表達(dá);利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測SIRT2與α微管蛋白(α-tubulin)在小鼠1-細(xì)胞期受精卵中的共定位情況,初步闡述SIRT2與小鼠1-細(xì)胞期受精卵的關(guān)系,探究SIRT2在小鼠早期胚胎有絲分裂中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用昆明系SPF級小鼠購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,均于恒溫恒濕(溫度25～27 ℃,濕度保持在50%～52%范圍)動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)。其中雌性小鼠,培育時(shí)間為4～6周,體質(zhì)量20～25 g;雄性小鼠,培育時(shí)間8周及以上,體質(zhì)量35～45 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

孕馬血清促性腺激素(寧波三生);人絨毛膜促性腺激素(赤峰博恩);透明質(zhì)酸酶、M16培養(yǎng)液、礦物油(Sigma);RNAfast200-總RNA極速提取試劑盒(上海飛捷生物);One-Step gDNA Removal試劑盒(全式金),qPCR 試劑盒(全式金);Anti-SIRT2 antibody,Anti-βactin antibody(SantaCruz biotechnology);HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(北京中杉);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Piece Biotechnology);FITC-Alexa Fluor 594 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG,FITC-Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-goat IgG(proteintech)。

1.3 小鼠受精卵的采集和培養(yǎng)

準(zhǔn)備4～5周齡昆明系SPF級雌性小鼠40只,在動(dòng)物房照明條件明暗交替、溫度濕度條件適宜的情況下繼續(xù)培育1周。根據(jù)前文所述[8]進(jìn)行小鼠超數(shù)排卵。在以上工作完成后,于當(dāng)日18:00將完成超排卵的雌性小鼠與在相同條件下培養(yǎng),8～12周齡的昆明系SPF級雄性小鼠1∶1合籠過夜。次日清晨8:00檢栓,若雌鼠出現(xiàn)陰栓則視為受精成功。將帶有陰栓的雌性小鼠采用脫頸椎法處死,取出兩側(cè)輸卵管放入0.9%氯化鈉溶液液滴中。在體式顯微鏡下,利用1 mm注射器刺破輸卵管壺腹部膨大處,使受精卵-卵丘細(xì)胞復(fù)合物流出,隨后將以上細(xì)胞團(tuán)放入含有0.3%透明質(zhì)酸酶中的M16培養(yǎng)液中,去除受精卵周圍附著的卵丘細(xì)胞。將洗凈裸卵放入提前加入M16和礦物油的培養(yǎng)皿中,置于恒溫恒濕CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。據(jù)此研究[9]確定各期受精卵的收集時(shí)間。

1.4 qRT-PCR

分別取200個(gè)左右G1、S、G2和M期1-細(xì)胞期受精卵放于不同離心管中,密封保存,按照RNAfast200-總RNA極速提取試劑盒說明書提取mRNA;利用紫外分光光度計(jì)對提取的mRNA進(jìn)行吸光度檢測,計(jì)算260 nm與280 nm波長下吸光度的比值,比值在1.8～2.0范圍內(nèi),表明提取的mRNA純度高,可以進(jìn)行RT-PCR。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測得該批次提取的mRNA純度高,可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)處理,準(zhǔn)備1 μL提取的mRNA、4 μL 5×TransScript All-in-One SuperMix、1 μL gDNA Remove、14 μL Free-RNAse水,依次加入到反應(yīng)試管中混合均勻,反應(yīng)條件為42 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s完成體外反轉(zhuǎn)錄。按照TransScript試劑說明書進(jìn)行q-PCR來檢測SIRT2 mRNA的含量,引物序列見表1,反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性30 s,94 ℃5 s,60 ℃ 15 s,45個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,56 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s,1個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列

表2 qPCR反應(yīng)體系

1.5 Western blotting

取G1、S、G2和M四個(gè)時(shí)相的小鼠1-細(xì)胞期受精卵200個(gè),按常規(guī)方法提取受精卵中的總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,將蛋白置于提前加熱的100 ℃水浴鍋煮沸7～10 min。將變性蛋白與適量buffer混合稀釋成適合的濃度,與marker分別加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi),每孔30 μL。完成點(diǎn)樣后,進(jìn)行電泳。于70 V 30 min、120 V 60 min的條件下跑膠。隨后將凝膠取出,置于冰盒內(nèi)4 ℃轉(zhuǎn)膜2 h,將條帶轉(zhuǎn)移至NC膜上。隨后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;將封閉處理的NC膜加入按1∶1 000稀釋的Anti-SIRT2 antibody和Anti-βactin antibody中,4 ℃孵育過夜。第2天將NC膜移入1∶1 000 HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG中,在室溫條件下孵育2 h。隨后使用TBST溶液對含有目的條帶的NC膜進(jìn)行脫色,重復(fù)3次,每次20 min。按說明書加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑,利用Bio-Rad顯微成像系統(tǒng),以β-actin為內(nèi)參,分析蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平。

1.6 細(xì)胞免疫熒光共定位

取1-細(xì)胞期G1、S、G2、M四個(gè)時(shí)相和即將進(jìn)入2-細(xì)胞期G1期的受精卵用PBS洗液處理3遍,以去除細(xì)胞表面的透明帶。向處理后的受精卵中加入適量的4%多聚甲醛固定,在室溫條件下放置1 h;完成后加入PBST溶液將上述樣品洗滌3次,每次處理時(shí)間為5 min;最后用0.1%Triton X-100透化,打孔30 min。PBS(含5%BSA)封閉液封閉1 h。

將處理完成的受精卵轉(zhuǎn)入一抗,在4 ℃條件下處理5 min,再洗滌3次;將處理后的受精卵轉(zhuǎn)入二抗中,在室溫條件下避光處理,放置時(shí)間為1 h;再洗滌3次,之后用Hoechst33258對上述樣品進(jìn)行染色處理,靜置時(shí)間為10 min,使核酸染色。在激光共聚焦掃描顯微鏡下,觀察SIRT2和α-tubulin在受精卵中的定位及核酸染色情況,根據(jù)α-tubulin和核酸分布可確認(rèn)紡錘體和染色質(zhì)位置,從而確認(rèn)M期進(jìn)程。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SIRT2在小鼠受精卵早期發(fā)育進(jìn)程中表達(dá)譜

結(jié)果顯示:S組、G2組、M組與G1期SIRT2 mRNA表達(dá)水平相比,S組和G2組高于G1組,G2組高于S組和M組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);SIRT2在1-細(xì)胞期受精卵的四個(gè)時(shí)期(G1、S、G2、M期)的蛋白相對表達(dá)水平,S組和G2組高于G1組,G2組高于M組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表3、圖1)。SIRT2蛋白與其mRNA的表達(dá)變化趨勢一致,在G1期最低,從G1向G2過渡時(shí)持續(xù)增加,于G2期達(dá)到峰值,隨后向M期過渡時(shí)降低。

表3 1-細(xì)胞期受精卵的SIRT2 mRNA和蛋白表達(dá)水平

2.2 SIRT2和α-tubulin在小鼠1-細(xì)胞期受精卵各期的共定位情況

在轉(zhuǎn)染的小鼠1-細(xì)胞期受精卵中,可見紅色熒光標(biāo)記的SIRT2與綠色熒光標(biāo)記的α-tubulin定位一致。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SIRT2在G1期定位于細(xì)胞皮質(zhì)且表達(dá)強(qiáng)度最弱(見圖2A),隨著受精卵由G1期向G2期過渡,SIRT2逐漸由細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)域向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移,表達(dá)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng),在G2早期表達(dá)強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)峰(見圖2B、2C);而當(dāng)受精卵由G2向M期過渡時(shí),部分SIRT2入核向染色質(zhì)凝集區(qū)聚集,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)強(qiáng)度逐漸減弱(見圖2D),根據(jù)α-tubulin和染色體的分布情況,入核的SIRT2和M中期紡錘體定位一致(見圖2E);隨著M期結(jié)束,在向2-細(xì)胞期轉(zhuǎn)變過程中,紡錘體消失,染色質(zhì)移向兩極,SIRT2在受精卵重新定位于細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)域(見圖2F、G、H)。推測SIRT2在某種條件下完成了核質(zhì)穿梭并參與G2/M轉(zhuǎn)換。在小鼠1-細(xì)胞期受精卵細(xì)胞周期中,SIRT2的亞細(xì)胞定位呈現(xiàn)出紡錘體動(dòng)力學(xué)依賴性。

3 討論

受精卵的有絲分裂停滯和及時(shí)恢復(fù)是哺乳動(dòng)物有絲分裂的基本步驟。在酵母和甲殼類生物中,SIRT2是參與有絲分裂的關(guān)鍵蛋白質(zhì),在細(xì)胞周期時(shí)相轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[10-11]。在酵母細(xì)胞中,SIRT2通過和PR-Set7相互作用,在有絲分裂G2/M轉(zhuǎn)換期中參與表觀遺傳標(biāo)記H4K20me1的建立,從而影響S期進(jìn)展和基因組穩(wěn)定性[12]。SIRT2 缺陷動(dòng)物則表現(xiàn)出基因組不穩(wěn)定性和染色體畸變,腫瘤易感性也隨之增加[13-14]。而在哺乳動(dòng)物受精卵中,SIRT2是否同樣能夠影響有絲分裂進(jìn)程,目前相關(guān)研究較少。

本課題組通過qRT-PCR、Western blotting技術(shù),證明SIRT2在小鼠1-細(xì)胞期受精卵細(xì)胞周期進(jìn)程中存在,且SIRT2 mRNA和SIRT2蛋白的表達(dá)在細(xì)胞周期中呈時(shí)相依賴性變化。研究[15-16]表明,有絲分裂中紡錘體的形成與SIRT2修飾的微管蛋白的去乙酰化至關(guān)重要。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中,當(dāng)細(xì)胞處于G2/M過渡期時(shí),SIRT2通過核質(zhì)穿梭調(diào)節(jié)組蛋白H4 Lys16(H4K16Ac)脫乙酰化,從而調(diào)節(jié)染色體濃縮[17]。因此我們利用SIRT2和α-tubulin細(xì)胞免疫熒光共定位,發(fā)現(xiàn)在小鼠1-細(xì)胞期受精卵中,與常規(guī)亞細(xì)胞定位不同,SIRT2在有絲分裂期G2/M轉(zhuǎn)化時(shí)由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核定位于紡錘體。我們推測在小鼠1-細(xì)胞期受精卵的G2/M轉(zhuǎn)換期中,SIRT2在某種條件下通過核質(zhì)穿梭調(diào)節(jié)紡錘體微管的動(dòng)力學(xué)和動(dòng)粒的功能,從而幫助實(shí)現(xiàn)有絲分裂間期向分裂期的轉(zhuǎn)變。

綜上所述,SIRT2在小鼠1-細(xì)胞期受精卵有絲分裂不同時(shí)相中存在表達(dá)差異和定位變化,或許能夠作為哺乳動(dòng)物受精卵細(xì)胞有絲分裂恢復(fù)的新的調(diào)節(jié)因子,這對于更好地理解有絲分裂的調(diào)控具有重要意義。由于實(shí)驗(yàn)條件限制,本課題組無法使用電鏡觀察中心粒的亞細(xì)胞定位,對于檢測SIRT2在1-細(xì)胞期受精卵的紡錘體組裝過程中的作用有待補(bǔ)充。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們將通過構(gòu)建SIRT2表達(dá)質(zhì)粒,過表達(dá)或沉默SIRT2后,觀察小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育狀態(tài);篩選SIRT2蛋白下游的染色質(zhì)蛋白及與靶蛋白具體的作用位點(diǎn),進(jìn)一步證明SIRT2對1-細(xì)胞期受精卵的正向調(diào)控作用,確認(rèn)SIRT2是否能夠作為受精卵G2/M轉(zhuǎn)換期檢測點(diǎn)以檢測細(xì)胞周期進(jìn)程。