circFOXK2靶向miR-4677-3p促進口腔鱗癌細胞增殖、侵襲和遷移

龔 瑤,李夢園,章 茜

(南京大學醫學院附屬口腔醫院 口腔頜面外科門診,江蘇 南京 210008)

口腔鱗癌(OSCC)是最常見的頭頸部腫瘤亞型,全球每年有超過35萬新確診病例和18萬死亡病例[1]。盡管在手術技術和放化療方面取得了較大進展,但OSCC病人總生存率并未得到明顯改善。OSCC具有局部侵襲性強和頸部淋巴結轉移特點,深入研究其進展和轉移分子機制是開發新型有效OSCC治療方法的關鍵。環狀RNA(circRNA)是由共價鍵形成的閉合型RNA分子,其包含miRNA特異性結合位點,可通過抑制miRNA的調控作用來調節mRNA表達,廣泛參與細胞代謝、增殖、轉移和凋亡等諸多生物學過程[2]。circFOXK2在胰管腺癌細胞和大多數原發腫瘤中顯著上調,促進細胞生長和侵襲,參與細胞周期進展[3]。然而目前鮮見circFOXK2和OSCC的相關報道。miR-4677-3p是肺癌的抑制因子,上調其表達能夠抑制肺癌細胞增殖和遷移[4]。此外,miR-4677-3p還介導敲減circ_0001421對肺癌細胞的惡性行為和糖酵解的抑制作用[5]。靶基因預測顯示miR-4677-3p是circFOXK2的潛在靶點,但circFOXK2靶向miR-4677-3p在OSCC進展中的調控作用并不清楚。為此,本研究重點探討circFOXK2和miR-4677-3p對OSCC惡性行為的影響和調控機制,旨在為OSCC的防治提供重要的實驗數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 OSCC組織 OSCC組織和匹配癌旁組織來源于2017年3月至2020年12月在我院行手術治療的45例OSCC病人,其中男32例,女13例,年齡48～75歲。所有OSCC病人在手術前均未接受過輔助放療或化療。所有樣本均由我院2位病理專家證實,然后立即在-80 ℃保存。病人均簽署知情同意書,且該研究獲得了我院倫理委員會的批準。

1.1.2 細胞和試劑 OSCC細胞HSC-3購自美國ATCC;Transwell板購自美國Corning公司;細胞計數試劑盒(CCK-8)購自北京博奧森公司;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔多抗(ab9485)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)兔多抗(ab97779)、MMP-9兔多抗(ab38898)購自上海艾博抗公司;重組報告質粒、si-NC、si-circFOXK2、模擬物陰性對照miR-NC、miR-4677-3p模擬物、pcDNA-circFOXK2、抑制物陰性對照anti-miR-NC、miR-4677-3p抑制物(anti-miR-4677-3p)、pcDNA購自蘇州鴻迅生物;逆轉錄試劑盒購自大連寶生生物公司;Power SYBRTM Green PCR Master Mix購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測circFOXK2和miR-4677-3p表達 采用Trizol試劑從OSCC組織中分離總RNA,RNA質量和濃度通過紫外分光光度法確定。用逆轉錄試劑盒合成cDNA,用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ進行RT-qPCR。用2-ΔΔCt法方法計算circFOXK2(GAPDH為內參)和miR-4677-3p(U6為內參)相對表達量。

1.2.2 細胞培養和分組 HSC-3細胞在補充有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基中培養,培養箱環境為37 ℃、含5%CO2。在6孔板中接種5×105個對數期HSC-3細胞,將Lipo2000與si-NC、si-circFOXK2、miR-NC、miR-4677-3p模擬物、pcDNA、pcDNA-circFOXK2、si-circFOXK2+anti-miR-NC、si-circFOXK2+anti-miR-4677-3p加入到60%融合度的HSC-3細胞中,培養48 h收獲細胞,RT-qPCR檢測circFOXK2或miR-4677-3p表達后用于進一步實驗。根據轉染序列或載體不同共分為si-NC組、si-circFOXK2組、miR-NC組、miR-4677-3p組、pcDNA組、pcDNA-circFOXK2組、si-circFOXK2+anti-miR-NC組、si-circFOXK2+ anti-miR-4677-3p組。

1.2.3 集落形成實驗檢測細胞克隆數 轉染48 h后,用胰酶消化細胞,將1×105個轉染細胞接種到6孔板,培養2周后,去除培養基,用4%多聚甲醛固定細胞集落10 min,隨后將細胞用0.5%結晶紫染色。顯微鏡下計數>50個細胞的克隆數。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活力 在96孔板中接種1×105個細胞,孵育2 d后每孔加入10 μL的CCK-8試劑,繼續孵育2 h,用酶標儀在450 nm處測定吸光度(OD)值。

1.2.5 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 用記號筆在6孔板背面劃一條直線。在6孔板中接種5×105個轉染細胞,37 ℃培養箱孵育至細胞基本融合,用200 μL移液管尖端沿6孔板背面直線劃傷單層細胞,PBS洗滌去除細胞碎片。繼續孵育24 h,顯微鏡下拍照,Image J軟件測定劃痕寬度,并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 用無血清培養基重懸轉染48 h的HSC-3細胞,取200 μL接種在預包被基質膠的上室中。在下室中加入完全培養液作為引誘劑。37 ℃培養24 h,用棉簽輕輕去除留在上表面的HSC-3細胞,將穿膜細胞固定,并進行結晶紫染色。在光學顯微鏡下隨機選擇5個視野拍照,以細胞數的均值表示侵襲數。

1.2.7 Western blotting檢測MMP-2和MMP-9蛋白水平 用預冷RIPA緩沖液提取總蛋白質,然后在SDS-PAGE上分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在5%脫脂牛奶中封閉1 h,將膜與適當濃度的一抗(包括MMP-2、MMP-9和內參GAPDH抗體)在4 ℃孵育過夜。用酶標二抗在室溫下與膜結合2 h。用化學發光檢測試劑盒檢測蛋白條帶,并使用Quantity One軟件分析目的蛋白相對灰度值。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗 分別將包含miR-4677-3p結合位點的circFOXK2野生(WT)序列或突變(MUT)序列分別克隆到psiCHECK-2報告載體,產生WT-circFOXK2、MUT-circFOXK2。在HSC-3細胞中共轉染報告質粒與miR-NC或miR-4677-3p模擬物,轉染48 h后檢測細胞裂解物中相對熒光素酶活性。

1.3 統計學方法

采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 circFOXK2和miR-4677-3p在OSCC組織中的表達

OSCC組織circFOXK2表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.01),miR-4677-3p表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.01)(見表1)。

表1 OSCC組織中circFOXK2和miR-4677-3p表達

2.2 抑制circFOXK2表達對HSC3細胞增殖、侵襲和遷移的影響

與轉染si-NC相比,轉染si-circFOXK2導致HSC3細胞circFOXK2表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.01)。與si-NC組相比,si-circFOXK2組HSC3細胞MMP-2和MMP-9蛋白水平、細胞OD值、克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲數均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01)(見表2、圖1)。

表2 抑制circFOXK2表達對HSC3細胞增殖、侵襲和遷移的影響

2.3 miR-4677-3p過表達對HSC3細胞增殖、侵襲和遷移的影響

與轉染miR-NC比較,轉染miR-4677-3p模擬物導致HSC3細胞miR-4677-3p表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.01)。miR-4677-3p組HSC3細胞MMP-2和MMP-9蛋白水平、細胞OD值、克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲數顯著低于miR-NC組(P<0.01)(見圖2、表3)。

表3 miR-4677-3p過表達對HSC3細胞增殖、侵襲和遷移的影響

2.4 circFOXK2靶向調控miR-4677-3p的表達

StarBase預測到circFOXK2的序列中含有miR-4677-3p的結合位點(見圖3)。與WT-circFOXK2共轉染時,轉染miR-4677-3p模擬物與轉染miR-NC相比導致細胞相對熒光素酶活性降低,差異有統計學意義(P<0.01)(見表4)。pcDNA-circFOXK2組HSC3細胞miR-4677-3p表達水平顯著低于pcDNA組(P<0.05),si-circFOXK2組HSC3細胞miR-4677-3p表達水平顯著高于si-NC組(P<0.05)(見表5)。

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 circFOXK2調控miR-4677-3p的表達

2.5 干擾miR-4677-3p表達逆轉抑制circFOXK2表達對HSC3細胞增殖、侵襲和遷移的作用

si-circFOXK2+anti-miR-4677-3p組HSC3細胞miR-4677-3p表達水平顯著低于si-circFOXK2+anti-miR-NC組(P<0.01),MMP-2和MMP-9蛋白水平、細胞OD值、克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲數顯著高于si-circFOXK2+anti-miR-NC組(P<0.01)(見圖4、表6)。

表6 干擾miR-4677-3p表達逆轉抑制circFOXK2表達對HSC3細胞增殖、侵襲和遷移的作用

3 討論

circRNA是新發現的功能性調節非編碼RNA,特定circRNA差異表達與各種癌癥的臨床特征顯著相關。目前已發現circ_0000140低表達與OSCC病人預后不良相關[6]。circ_101036通過誘導內質網應激來抑制OSCC細胞遷移和侵襲[7]。然而circ_002178高表達OSCC病人晚期病理分期和遠端轉移發生率較高,敲除circ_002178能夠有效抑制OSCC細胞增殖和侵襲[8]。闡明circRNA在OSCC發生和發展機制中的作用將為OSCC的治療提供新的方向。本研究檢測到OSCC組織中circFOXK2表達增加,抑制circFOXK2表達導致HSC3細胞活力和克隆形成數降低,遷移和侵襲能力降低,表明抑制circFOXK2表達具有抗增殖、抗轉移作用。腫瘤轉移涉及多個步驟,其中MMPs是腫瘤細胞降解細胞外基質并向局部或遠處延伸的必要條件[9]。在包括OSCC在內的多種腫瘤中MMP-2和MMP-9異常表達或激活與腫瘤侵襲或轉移有關[10-11]。本研究檢測轉移相關標志蛋白MMP-2和MMP-9的表達水平,結果顯示,抑制circFOXK2表達導致HSC3細胞中MMP-2和MMP-9蛋白下調,transwell實驗結果與之一致。以上研究表明circFOXK2在OSCC進展中扮演致癌基因角色。

研究[12-13]顯示circRNA可結合miRNA調控腫瘤進展。本研究證實miR-4677-3p是circFOXK2的靶點,過表達circFOXK2可抑制miR-4677-3p表達,而抑制circFOXK2則促進miR-4677-3p表達。miR-4677-3p已被證明在人類癌癥中異常表達并調控癌癥進展。如在胃癌中miR-4677-3p異常低表達,miR-142-5p的上調可抑制胃癌細胞增殖和遷移[14];LINC00313通過下調miR-4677-3p表達水平,誘導CDK6表達上調,從而促進宮頸癌進展[15];miR-4677-3p還作為TTN-AS1和LINC02418等lncRNA的下游miRNA來抑制肺癌進展[16-17]。本研究中,OSCC組織中miR-4677-3p表達明顯降低,過表達miR-4677-3p可下調MMP-2和MMP-9蛋白表達,并抑制HSC3細胞活力、遷移、克隆形成和侵襲能力降低,這與抑制circFOXK2表達的抗癌作用類似。為證實抑制circFOXK2的作用是通過上調miR-4677-3p表達實現的,本研究共轉染si-circFOXK2和anti-miR-4677-3p至HSC3細胞,結果顯示,下調miR-4677-3p表達顯著減弱抑制circFOXK2表達對HSC3細胞惡性行為的影響。這些結果表明circFOXK2靶向miR-4677-3p調控OSCC細胞的惡性行為。然而,本研究并未在動物實驗中驗證circFOXK2和miR-4677-3p的功能,這將是下一步研究的重點。

總之,本研究表明抑制circFOXK2可通過促進miR-4677-3p表達來抑制OSCC細胞增殖、遷移和侵襲,這些發現有助于理解OSCC的發病機制,并可能為OSCC的治療提供新靶點。