釀酒酵母Y-8對發酵香腸品質與風味的影響

范鑫洋，張香美，劉程鵬，紀錫偉，車 淇

（河北經貿大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050061）

近年來，隨著消費者綠色健康觀念的增強，發酵香腸逐漸趨向于低鹽、低脂化，但此類發酵香腸存在香氣缺陷[1]。酵母菌作為一種潛在的生香菌株，能將糖等有機物轉化成乙醇、CO2以及一系列芳香化合物[2]，接種到發酵香腸中可以改善其香氣和口感[3]。Flores等[4]發現，酵母菌在香腸發酵過程中能夠消耗乳酸，提升發酵香腸pH值并產生酯類化合物，有助于增強發酵香腸的果味與腌制香味；Lü Jing等[5]研究表明，酵母菌的添加可以改善由傳統乳酸菌發酵肉制品造成的滋味過酸、香氣缺陷及感官品質不佳等問題；Panda等[6]認為，酵母菌主要通過發酵改善食品質地、提高產品營養價值。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）常作為乙醇類飲料和面包的發酵劑，具有脂解活性、蛋白水解活性，可以產生醇、酯等風味化合物，具有作為肉類發酵劑的潛力，已報道的適用于肉類發酵的釀酒酵母菌株有Y70[1]、LXPSC1[5]等。本研究擬將分離自發酵面團的釀酒酵母Y-8接種到發酵香腸中，探究其對發酵香腸品質和風味的影響，為釀酒酵母在發酵香腸中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉 石家莊市雙鴿集團；菌種：植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）Z43、釀酒酵母Y-8由河北經貿大學生物科學與工程學院益生菌研究室分離并保存。

恒康精制天然豬腸衣（直徑25 mm）北京京東世紀貿易有限公司；YPD液體培養基 青島海博生物技術有限公司；MRS培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

759CKT紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；CM-700d1分光測色計 日本柯尼卡美能達公司；LE427 pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；CT3質構儀 美國博勒飛有限公司；3K15離心機 德國Sigma公司；FlavourSpec?風味分析儀德國G.A.S公司；Trace ISQ氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵香腸的制作

工藝流程：原料肉處理→加入調味品→攪拌均勻→接入發酵劑→攪拌均勻→灌腸→發酵→成品。

分別將活化好的植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8接種到MRS和YPD液體培養基中37 ℃培養24 h。然后于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌3 次后重懸[7]。

發酵香腸制作方法及配方參考裴正鈺[8]的方法。實驗共分4 組：CK組接種植物乳植桿菌Z43；A組植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8接種比例為20∶1；B組植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8接種比例為10∶1；C組植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8接種比例為5∶1。其中，植物乳植桿菌Z43接種量均為107CFU/g。將制作完成的發酵香腸置于37 ℃發酵3 d。

1.3.2 發酵香腸感官評價

參考曹辰辰等[9]的方法并作修改。對不同組別的發酵香腸進行感官評定，選取10 名經過專業培訓的人員組成評定小組，隨機對各組別發酵香腸進行品嘗。分別從顏色、氣味、組織狀態和滋味4 個方面對樣品進行感官評價。具體評分標準見表1。

表1 發酵香腸感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented sausages

1.3.3 發酵香腸pH值測定

取發酵0、1、2、3 d的各組發酵香腸，利用pH計進行測定。

1.3.4 發酵香腸色度測定

參考曹辰辰[10]的方法并稍作修改。將發酵結束后的發酵香腸切成直徑2 cm、厚度1 cm的平整圓柱體，利用校準后的色差儀進行色度測定，記錄亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。每組樣品做3 個平行實驗。色度值（C）按下式計算[11]：

1.3.5 發酵香腸質構測定

參考文港等[12]的方法稍作修改。取發酵結束后的發酵香腸，切成厚度與直徑均為2 cm的平整圓柱體，質構儀選取TA3/100圓柱形探頭與TA-RT-KIT夾具，運行速率1 mm/s、觸發點負載10 g、壓縮度30%、等待時間0 s，測定硬度、彈性、膠著性和咀嚼性。每個樣品重復測定3 次。

1.3.6 發酵香腸腸桿菌數測定

參照GB 4789.41—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 腸桿菌科檢驗》[13]。

1.3.7 發酵香腸揮發性風味物質測定

使用風味分析儀進行揮發性風味物質測定。取3.0 g樣品置于20 mL頂空瓶中，在60 ℃條件下，以500 r/min的轉速孵育20 min后進樣。頂空進樣單元的設定條件為：進樣體積200 μL、進樣針溫度85 ℃。每組發酵香腸平行測定3 次。

GC相關參數為：WAX色譜柱（30 m×0.53 mm，1 μm），色譜柱溫度60 ℃；離子遷移譜（ion mobility spectrometry，IMS）溫度為45 ℃，載氣為N2，分析時間30 min，載氣起始流速為2 mL/min，10 min時增至10 mL/min，20 min時增至100 mL/min，直至分析結束。

采用C4～C9正構酮為標準品進行定性。

1.3.8 發酵香腸脂肪酸組成測定

參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》[14]中的方法稍作修改。

色譜條件：TG-FAME色譜柱（50 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度120 ℃，保持1 min；以7 ℃/min升溫至198 ℃，保持10 min；以3 ℃/min升溫至230 ℃。

質譜條件：電子電離源，電離能量70 eV，離子源溫度280 ℃，全掃描模式，質量掃描50～500 au，溶劑延遲3 min。

1.4 數據處理

所有數據均以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 26軟件進行顯著性分析，用GraphPad_Prism_8.0.2.263軟件進行作圖。利用SIMCA 14.1軟件進行主成分分析（principal components analysis，PCA）與正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）。

2 結果與分析

2.1 不同酵母添加量對發酵香腸感官評價的影響

由圖1可知，接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組發酵香腸的氣味評分均高于CK組（7.07）。A組的滋味（8.60）、組織狀態（8.51）、氣味（8.63）與顏色（8.86）的感官評分均高于其余3 組。隨釀酒酵母Y-8接種量的增加，滋味與組織狀態的評分逐漸降低。推測是因為釀酒酵母Y-8接種量過大導致產氣過多，從而使組織狀態變差，滋味也受到一定影響。接種釀酒酵母Y-8可以改善發酵香腸的香氣，但接種過量釀酒酵母Y-8可能會影響發酵香腸的滋味與組織狀態。植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8以20∶1比例復配發酵香腸色澤鮮亮、肉餡鮮紅、切面較為緊實、無明顯酸味、滋味與氣味評分最高，且綜合評分（34.6）最佳。

圖1 不同發酵香腸感官評價Fig.1 Sensory evaluation results of different fermented sausages

2.2 不同酵母添加量對發酵香腸pH值的影響

由圖2可知，在發酵0～2 d過程中，各組發酵香腸pH值呈下降趨勢；在發酵2～3 d過程中，A、B組pH值有所上升。這與Lü Jing[5]、Flores[4]等研究結果一致，發酵后期pH值的升高可能與酵母菌通過同化作用消耗有機酸有關。在發酵1 d時，A、B組的pH值迅速降低至5.0以下，然后緩慢下降。Flores等[15]研究認為，較低的pH值可以抑制有害細菌生長，有助于保持產品安全性并延長保質期。A、B、C組樣品在發酵結束時pH值均高于CK組，接種釀酒酵母Y-8可以提高發酵香腸最終pH值，推測接種釀酒酵母Y-8可以有效消耗由乳酸菌發酵產生的乙酸、乳酸等有機酸，祛除發酵香腸因乳酸菌代謝產生的酸味。

圖2 不同發酵香腸發酵過程中pH值變化Fig.2 Changes in pH of different fermented sausages during fermentation

2.3 不同酵母添加量對發酵香腸色度的影響

肉制品外觀是影響消費者購買的主要因素，優良的外觀比產品口感更重要[16]。在產品色澤判定中，C代表飽和度，C越大表明樣品飽和度越高、顏色越純[11]。由表2可知，4 組發酵香腸C無顯著差異，其中，A組的C（12.42±0.71）最大。接種釀酒酵母Y-8發酵香腸的a*與b*與CK組無顯著差異，但A組與B組的L*顯著低于CK組（P＜0.05），說明植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8以20∶1和10∶1比例接種可以降低發酵香腸亮度。

表2 不同發酵香腸色度測定結果Table 2 Color parameters of different fermented sausages

2.4 不同酵母添加量對發酵香腸質構的影響

肉制品的質地被認為是影響消費者接受程度的最重要質量決定因素[17]。由表3可知，A組與CK組發酵香腸彈性、膠著性與咀嚼性無顯著差異，但A組發酵香腸的硬度顯著高于CK組（P＜0.05）；B、C組發酵香腸彈性與其余2 組無顯著差異，但硬度、膠著性顯著低于CK組和A組（P＜0.05）。植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8比例為20∶1的發酵劑有利于改善發酵香腸的質構。B、C組發酵香腸的硬度顯著低于CK組（P＜0.05），且釀酒酵母Y-8接種量越大，發酵香腸硬度越低，這與蘭沁潔[18]的研究結果一致，認為是因為乳酸菌和酵母菌的協同作用，加速蛋白質消耗，使得硬度降低。

表3 不同發酵香腸質構測定結果Table 3 Texture characteristics of different fermented sausages

2.5 不同酵母添加量對發酵香腸腸桿菌數的影響

由圖3可知，在發酵過程中，各組發酵香腸的腸桿菌數均呈下降趨勢。發酵2 d時，CK組發酵香腸的腸桿菌數為3.15（lg（CFU/g）），而接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組腸桿菌數降為0。由此可看出，釀酒酵母Y-8與植物乳植桿菌Z43復配發酵能增強抑菌能力，抑制或殺死腸桿菌，加快腸桿菌數的下降。García-Béjar等[19]證實了酵母菌對豬肉發酵香腸存在抑菌作用。添加釀酒酵母Y-8可以增強發酵香腸的抗菌能力，有效抑制腸桿菌生長，提高發酵香腸的安全性。

圖3 不同發酵香腸發酵過程中腸桿菌數變化Fig.3 Changes of Enterobacter count in different fermented sausages during fermentation

2.6 不同組別發酵香腸總體揮發性風味物質差異分析

2.6.1 不同組別發酵香腸揮發性風味物質分析

由圖4可知，4 組發酵香腸的揮發性化合物通過GC-IMS被很好地分離，具有明顯差異。共檢測并識別出49 種化合物，其中醛類6 種、醇類12 種、酯類11 種、酮類10 種、酸類2 種、烯烴類2 種、吡嗪類3 種、其他類3 種。

圖4 不同發酵香腸GC-IMS二維譜圖Fig.4 Two dimensional GC-IMS maps of different fermented sausages

各揮發性風味物質峰體積具體數值見表4。利用GC-IMS所得不同組別的同一揮發性風味物質的峰體積大小在一定程度上代表物質含量多少。

表4 不同發酵香腸揮發性風味物質定性分析結果Table 4 Qualitative analysis results of volatile compounds in different fermented sausages

為進一步直觀對比不同組別發酵香腸揮發性物質的差異，選取3 次平行的所有峰進行指紋圖譜對比（圖5）。在指紋圖譜中，圖中各點顏色的深淺代表揮發性化合物含量差異。由表4與圖5可知，接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組發酵香腸中乙酸二聚體含量低于CK組，且A組發酵香腸顯著低于CK組（P＜0.05），可有效降低發酵香腸酸味。

圖5 不同發酵香腸揮發性風味物質指紋圖譜Fig.5 Gallery fingerprint of volatile flavor compounds in different fermented sausages

醇類揮發性風味物質主要是由酵母菌的生理活動以及脂質氧化、氨基酸代謝和微生物繁殖產生的必需風味成分[27]。接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組發酵香腸中6 種醇類化合物（1-戊醇二聚體、異戊醇單體、異戊醇二聚體、順-3-壬烯醇、異丁醇二聚體、1-己醇單體）含量明顯高于CK組，賦予發酵香腸強烈的醇香。1-戊醇二聚體和異戊醇二聚體等醇類物質增強了發酵香腸的燒烤味和奶酪味。異戊醇二聚體、異丁醇二聚體的含量隨釀酒酵母Y-8接種量的增大顯著增加，賦予發酵香腸醇香和奶酪香。

Liu Yingli等[28]研究發現，在發酵香腸中接種酵母菌可以促進乙酸乙酯等酯類的生成，與乳酸菌相比，酵母菌在風味形成中的貢獻更大。接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組發酵香腸中乙酸戊酯、丙酸乙酯二聚體、乙酸乙酯二聚體、醋酸異丙酯、順乙酸-3-己烯酯5 種酯類化合物含量明顯高于CK組。乙酸戊酯、丙酸乙酯二聚體、乙酸乙酯二聚體、醋酸異丙酯增強了發酵香腸的甜香與水果香，賦予發酵香腸濃烈的酯香。乙酸異戊酯二聚體、乙酸異戊酯單體、丙酸乙酯二聚體和乙酸戊酯的含量隨釀酒酵母Y-8接種量的增加而增大，賦予發酵香腸甜香與果香。

A、B、C組發酵香腸2,6-二甲基吡嗪單體與2,6-二甲基吡嗪二聚體的含量明顯高于CK組，賦予發酵香腸巧克力香氣。A組發酵香腸3-羥基-2-丁酮的含量明顯高于其余3 組，增強了發酵香腸的黃油味。

添加釀酒酵母Y-8具有香氣改良作用，但隨著釀酒酵母Y-8添加量的增加，B、C組的己醛單體、己醛二聚體、1-己醇二聚體含量逐漸增多，產生較多蔬菜、青草等植物香氣。

2.6.2 不同組別發酵香腸揮發性風味物質PCA

PCA是一種無監督的降維分析方法，一定程度反映了數據的原始狀態[29]。PCA圖可以直觀地顯示不同樣品之間的差異，由圖6A可知，揮發性風味物質的PC1貢獻率為56.1%，PC2貢獻率為22.5%，總貢獻率為78.6%，說明結果可接受。同一組別發酵香腸的重復性較好，不同組別發酵香腸之間距離較遠，表明添加釀酒酵母Y-8復配發酵香腸與單獨的植物乳植桿菌Z43發酵香腸揮發性風味化合物存在明顯差異。載荷圖（圖6B）可以直觀反映不同揮發性風味物質在PCA圖中的貢獻，如乙酸二聚體對CK組貢獻較大，異戊醇單體對A組貢獻較大，1-己醇單體對B、C組貢獻較大。載荷圖與PCA圖可以更好地反映不同組別發酵香腸揮發性風味物質的差異。

圖6 不同發酵香腸揮發性化合物PCA圖（A）和載荷圖（B）Fig.6 PCA score (A) and loading plots (B) of volatile compounds in different fermented sausages

2.6.3 OPLS-DA模型分析

OPLS-DA評價模型中，為X矩陣的解釋率，為Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力[25]。此次實驗模型中＝0.962、＝0.981、Q2＝0.948，表明OPLS-DA模型的預測能力較好。由圖7A可知，4 組發酵香腸的樣品在OPLS-DA得分散點圖中可以被很好地區分，證明OPLS-DA模型能夠較好地獲取組間差異信息，可以將不同組別發酵香腸的揮發性風味物質進行區分。為防止過擬合發生，進行200 次交叉驗證。如圖7B所示，Q2的回歸線與縱軸相交點小于0，說明此模型無過擬合現象，模型驗證有效[30]。因此認為此結果可以用于不同組別發酵香腸揮發性風味物質的區分。

圖7 不同發酵香腸揮發性成分OPLS-DA得分圖（A）和模型置換檢驗圖（B)Fig.7 OPLS-DA score (A) and permutation test plots (B) for volatile components in different fermented sausages

2.6.4 不同組別發酵香腸特征性揮發性風味物質分析

為進一步體現不同組別發酵香腸揮發性風味物質差異，對OPLS-DA模型的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值進行計算，揮發性風味物質的VIP值越大，說明在不同處理下此揮發性風味物質的差異越顯著[31]。由圖8A可知，共篩選出17 種VIP＞1的揮發性風味物質，其中3-羥基-2-丁酮的VIP值最大，為2.5。3-羥基-2-丁酮為發酵香腸提供了黃油香氣，其通常在乳酸菌的作用下與檸檬酸鹽和乳糖代謝相關，并且也可以通過氨基酸分解代謝產生[32]。VIP＞1的揮發性風味物質有3-羥基-2-丁酮、乙酸乙酯二聚體、異丁醇二聚體、丙醛、異戊醇二聚體、甲酸乙酯、正丁醇二聚體、己醛二聚體、乙酸二聚體、丙酮、2,6-二甲基吡嗪二聚體、2,6-二甲基吡嗪單體、正丁醇單體、醋酸異丙酯、異戊醇單體、丙酸乙酯單體和異丁醇單體。

圖8 不同發酵香腸VIP值（A）及其OPLS-DA圖（B）Fig.8 VIP score map (A) and OPLS-DA plot (B) for differential volatile flavor compounds among different fermented sausages

對上述17 種揮發性風味物質進行PCA，由圖8B可知，累計貢獻率為84.4%，涵蓋大多數樣品特征，說明此17 種揮發性風味物質可以較好地區分不同組別發酵香腸。CK組的揮發性風味物質與接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組存在較大差異。各揮發性風味物質碎片與各組的距離代表化合物含量，距離越近說明含量越高。距離A組較近的揮發性風味物質有異戊醇單體、3-羥基-2-丁酮、甲酸乙酯與異丁醇單體，說明這幾種風味成分在A組中含量最高，這與指紋圖譜結果一致。Mi Ruifang等[1]報道，釀酒酵母Y70在發酵香腸模型培養基中產生的特色風味成分為異戊醇。B、C組己醛含量較多，增加了發酵香腸青草植物香氣；CK組酯類物質含量較少；A組發酵香腸揮發性風味物質最優。

2.7 不同酵母添加量對發酵香腸脂肪酸組分的影響

采用GC-MS測定不同組別的脂肪酸含量，由表5可知，共檢測出9 種脂肪酸，4 組發酵香腸的脂肪酸組成基本相似。飽和脂肪酸中肉豆蔻酸的相對含量隨釀酒酵母Y-8接種量的增加呈下降趨勢，且C組肉豆蔻酸相對含量顯著低于CK組（P＜0.05）。單不飽和脂肪酸中，油酸相對含量隨釀酒酵母Y-8接種量的增加呈上升趨勢，且C組油酸相對含量顯著高于CK組（P＜0.05）。高油酸含量被證明可以降低膽固醇水平及動脈粥樣硬化風險[33]。多不飽和脂肪酸中亞油酸為n-6脂肪酸，有助于減少與人類心血管疾病相關的一些因素，同時是預防人類必需脂肪酸缺乏癥所必需的脂肪酸[34]，接種釀酒酵母Y-8對發酵香腸亞油酸相對含量無顯著影響。綜上所述，接種釀酒酵母Y-8可以有效降低肉豆蔻酸相對含量，提高發酵香腸中油酸的相對含量，具有更高的營養價值，更符合健康營養理念，故釀酒酵母Y-8可以調整脂肪酸組成，對發酵香腸的脂肪酸組成具有改良作用。

表5 不同發酵香腸脂肪酸相對含量Table 5 Relative fatty acid contents of different fermented sausages %

3 結論

接種釀酒酵母Y-8可以有效抑制腸桿菌生長，提高發酵香腸的安全性；增加酯類與醇類化合物，賦予發酵香腸酯香與醇香風味；降低乙酸二聚體含量；有效消除發酵香腸酸味。隨著釀酒酵母Y-8接種量升高，發酵香腸的硬度顯著降低、油酸相對含量顯著增加。

通過建立OPLS-DA預測模型，篩選出17 種特征風味物質，結合PCA可對不同組別發酵香腸進行區分。其中差異最顯著的揮發性風味物質為3-羥基-2-丁酮，為發酵香腸提供了黃油香氣。釀酒酵母Y-8與植物乳植桿菌Z43復配發酵香腸的品質優于植物乳植桿菌Z43單菌發酵香腸，釀酒酵母Y-8可以改善發酵香腸的品質及風味，A組發酵香腸（植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8接種比例20∶1）的品質較優。本研究可為酵母菌在發酵香腸中的應用提供參考。