微生物源示蹤技術在食品鏈中進行污染源追溯的研究進展

樊麗華，王江雪，歐宗沅，張艷茹，張璐瑤，劉詩藝，周自梅，李國梁

（陜西科技大學食品科學與工程學院，陜西 西安 710021）

隨著人口快速增長和畜牧養殖業發展，糞便污染問題備受關注。人與動物的糞便通常含有多種腸道病原菌，如甲肝病毒、弧菌、沙門氏菌[1]。而未經處理的人類排泄物和畜禽養殖糞便在任意堆積和排放后，經雨水沖刷、地表徑流、地下徑流等途徑最終會進入湖泊和海洋，從而導致全球水域污染[2]。水體中糞便污染致使每年全球范圍內有大量海灘和水產養殖區倒閉、造成食物腐爛、給人類健康造成嚴重威脅，并帶來巨大的經濟損失[3]。另外，在發展中國家，很多人將帶有病原菌的河流和湖泊作為灌溉水，并將未經處理的糞便作為農業用肥，最終導致直接污染食品原材料[4]。因此，糞便污染是造成從農場到餐桌整個食品鏈污染的重要因素，直接威脅食品安全。

為監測和控制糞便污染情況發展并及時采取相應干涉措施，傳統上會利用與糞便污染具有緊密關聯的糞便指示菌，如糞大腸菌、大腸埃希氏桿菌、腸球菌屬等指示污染，但這些傳統糞便指示物僅能反映環境受糞便污染的程度，并不能判別糞便污染的確切來源，亦不能評價各個污染源的污染貢獻率[5]。“治病治其根，治污需溯源”，因此，需要了解糞便污染的源頭，以對健康風險進行評估并及時采取相應干涉措施。水體糞便污染主要分為點源污染和非點源污染。點源污染是指糞便污染來源相對比較明確、通過源定位容易控制的污染，主要污染途徑有生活與工業污水排放、污水處理廠污水泄漏等[4]。相對于點源污染，非點源污染沒有固定排污地點，例如農業化肥、野生動物排泄等[3]。非點源污染因其隨機性、散在性、廣泛性和多樣性等特點給管理和監控造成巨大困難，目前已成為全球水環境、近岸海域及水產品安全監管的瓶頸[6]。為彌補傳統糞便污染監測方法的不足，一種識別糞便污染源的新技術，即微生物源示蹤（microbial source tracking，MST）技術，已成為近年研究的關注點[7]。MST技術利用指示微生物本身或其特有的基因指紋或宿主特異性分子標記作為污染源的示蹤指示物，通過比較受污染樣品與可疑糞便源中指示物的差異或其生物指示物的有無判斷是否與可疑污染源存在關聯，從而確定污染來源。MST技術不僅能識別糞便污染來源，也能評價單一污染源的污染貢獻率，為評價水體污染風險、控制最大排放量和制定相關政策提供依據與數據支持[8]。目前，發展中國家在非點源污染的MST領域研究甚少，對于篩選宿主特異性分子標記作為糞便污染源的原創性研究更是幾乎空白。從世界范圍看，歐美等發達國家在污染源追蹤方面的技術均比較先進，其中細菌源追蹤技術較成熟。目前為止，MST技術的應用大部分集中在水體中糞便污染源的追溯，但其他方面也有更加廣泛的應用，尤其在食源性致病菌的污染源示蹤和保證食品安全方面。

本文簡要介紹MST的分類，著重闡述非依賴數據庫型方法（library-independent methods，LIMs）和分類及基于特異性分子標記物的MST方法在食品鏈中的應用。還對MST技術進行了展望，以期在應用研究中保證溯源結果更準確。

1 MST的方法

MST技術能高效、快速地識別糞便污染源并及時干預，減少危害的發生[9]。其優勢主要體現在：1）將分子生物學、生態學、生物信息學、統計學等學科有機地結合在一起，準確識別環境水域中非點源污染，特別是糞便污染的來源；2）可有效鑒定水體中細菌污染源種類的百分比，判定其來源；3）正確評估非點源污染水體的污染貢獻率；4）明確各已知污染源與病原微生物和污染危害之間的相關性；5）用于預測各已知污染源污染物的遷移規律和擴散途徑；6）鑒于MST的精確性，其分析結果有助于公共健康的風險管理。MST可分為依賴數據庫型方法（library-dependent methods，LDMs）和LIMs 2 類[10]。

1.1 LDMs

LDMs是指紋識別相匹配的過程，主要以微生物抗性指紋或基因多樣性指紋圖譜建立的指紋圖譜庫作為判別糞便污染來源的依據。將實際檢測得到的未知指紋與已建立圖譜庫進行對比，最終判斷宿主的確切來源。LDMs的關鍵是建立具有代表性和穩定性的數據庫，其質量主要取決于數據庫樣本量大小、所選用的微生物種類、數據庫的代表性及均衡性。

LDMs主要有2 類數據庫方法，分別以表現型與基因型為基礎。以表現型為基礎的數據庫方法主要包括微生物抗生素抗性指紋分析[10]、脂肪酸甲酯分析[11]及碳源利用[12]等；以基因型為基礎的數據庫方法主要包括核酸印跡法、脈沖電場凝膠電泳、擴增片斷長度多態性分析、重復序列擴增法、多位點序列分型法、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜等[13]，利用這些方法判別糞便污染來源。

以常用判別分析法的同源相似率作為評價指紋圖譜庫代表性和準確性的指標[14]。LDMs的優勢在于可以對污染源及其污染貢獻率進行分析，然而，由于建立數據庫需要大量樣本，相對比較耗時，且耗費大量人力和物力，導致LDMs的應用受到制約[15]。

1.2 LIMs

LIMs通過檢測某一宿主源特異性標志物的有無判別污染存在與否[16]。相比LDMs，LIMs因無需建立數據庫且簡便快速、精確度高而受到推崇。

LIMs分為依賴培養型方法和非依賴培養型方法2 種（圖1），可以根據源特異性菌群進行選擇性檢測。

圖1 基于原核生物核酸檢測的LIMs分類Fig.1 LIMs classification based on the detection of nucleic acid in prokaryotes

1.2.1 依賴培養型方法

依賴培養型方法效果直接受培養基的選取及培養條件等因素影響，因此標準化培養條件及相應技術是產生可重復結果的前提[17]。以糞便指示菌為基礎的方法利用水樣中糞大腸菌類與鏈球菌的比值（FC/FS）區別人與動物源糞便污染。然而，由于環境中糞大腸菌類與鏈球菌存活率的不同，FC/FS雖然可以在一定程度上反映糞便污染，但對判別污染源無明顯意義。此外，也有部分研究基于選擇性培養腸球菌，通過宿主特異性PCR實驗對分離的物種進行鑒定以此識別污染。然而，仍沒有一種單一的腸球菌能夠特異性指示污染源，而基于富集腸球菌后的多重PCR也只能在一定程度上識別污染源[18]；山梨糖醇發酵型雙歧桿菌（sorbitol-fermenting bifidobacteria，SFB）方法利用人類修飾型山梨糖醇瓊脂培養基，從樣品中選擇性培養SFB，以此對污染進行識別，此方法被認為是一種非常有前景的人類特異性MST方法并得到廣泛應用，然而Bonjoch等[19]指出，SFB在高溫和低堿性的水環境中僅能存活很短時間，且對樣品的采集要求較高，導致此方法應用受限。嗜糞紅球菌法是一種能夠對棲息在食草動物糞便中的源指示菌嗜糞紅球菌進行選擇性富集培養并分析以確定污染源的方法。然而，研究發現該指示菌雖具有較高的宿主糞便特異性且在環境中存活時間較長，但它在糞便中含量較低、培養過程耗時較長，因此該方法在MST實際應用中受到限制。

1.2.2 非依賴培養型方法

與依賴培養型方法不同，非依賴培養型方法主要是通過從樣品中提取核酸，進而篩選富集目的片段（大部分為16S rRNA或基因組序列）而建立的方法[20-21]。目前此方法所涉及到的特異性糞便源指示菌主要有擬桿菌群、產甲烷桿菌屬、紅球菌屬、糞桿菌、致病菌腸球菌、埃希氏桿菌屬及雙歧桿菌等（表1）。

表1 不同宿主的分子標記匯總Table 1 Summary of host-specific markers

1.2.2.1 菌群分析法

非依賴培養型方法主要是利用不同動物宿主糞便中的微生物菌群結構的不同，通過對菌群結構分析判斷糞便樣品來源。非依賴培養型菌群分析方法根據分析目標分為表型法和基因型方法2 種。

最常用的表型方法是磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acids，PLFAs）分析法，該方法的靶標物PLFAs是細胞膜的成分，且大多情況下PLFAs決定著微生物分類。在數據分析中，通常將環境中所有的PLFAs作為整體生物信息源，將特定物種的全部PLFAs或者特定PLFAs所占比例作為目標微生物或環境脅迫的指標來進行污染分析。例如，一些PLFAs可作為具有硫酸鹽還原功能菌體的分子標記物，另一些特定脂肪酸還可以指示重度金屬污染。

基因型方法是通過宏基因組分析方法對從環境樣品中提取的DNA進行直接分析或利用PCR方法從菌群DNA中擴增特異性的分子標記，隨后通過對PCR擴增產物進行如克隆測序（構建基因文庫）、長度多態性分析（T-RFLP、片段多態性分析、核糖體DNA限制性酶切分析、長度多態片段、自動化的核糖體基因間的間隔分析等）、探針雜交（基因芯片、微陣列等）、DNA變性（DGGE、溫度梯度凝膠電泳、單構象鏈多態）等，從而進行菌群結構分析[36]。基因型方法主要是以16S rRNA為目標建立相應的數據庫，且目前已形成了豐富的序列數據及大量數據庫，如核糖體數據庫項目[37]、綠色基因數據庫（greengenes.lbl.gov）。隨著計算生物學及生物信息學的發展，可使用的數據庫已迅速發展并成為數據處理中一種嶄新的工具，且很多基因設備能為菌群分析提供所需特定工具和專業技術知識，為此檢測方法的發展奠定了基礎[38]。然而該分析方法也存在一定缺陷，如在使用時需考慮DNA提取效率、PCR抑制及測序準確性和綜合性。

1.2.2.2 與宿主有關的分子標記方法

目前，獲取宿主特異性分子標記的基本方法共有2 種。第1種是從源指示菌中篩選出能在一定程度上指示宿主特異性的基因，根據基因序列設計引物，并對樣品糞便DNA進行PCR擴增，最終通過產物序列的分析比對進行宿主來源判斷[39]。在這種方法中，目標微生物及其基因和具有代表性的功能基因都是已知的，其中研究最普遍的是16S rRNA基因[40]。相比之下，第2種方法中目標基因未知，通過將宿主與非宿主的糞便DNA進行序列對比分析，挖掘出具有宿主特異性潛力的基因，其中一些基因的功能可能未知。

目前在基于宿主特異性分子標記的LIMs中，研究最多且應用較為廣泛的是利用16S rRNA作為分子標記來識別污染源。這些特異性分子標記物主要來自擬桿菌類、雙歧桿菌類、普拉梭菌及紅球菌屬等（表1），其中擬桿菌類的16S rRNA居多[41]。另外，在動物腸道微生物中也存在一些宿主特異性的宿主-微生物互作基因，這些基因已被用于追溯糞便污染源。例如，Shanks等[42]從牛腸道擬桿菌類基因中篩選出宿主-微生物互作基因，能夠將牛科糞便污染與其他反芻類動物糞便污染準確區分。這些功能基因被認為與和膜有關的分泌蛋白基因序列存在一定同源性，基于該功能基因所建立檢測方法的效果遠超過以16S rRNA基因為標記物所建立的方法。類似地，Fan Lihua等[43]利用宏基組學方法，富集篩選出宿主-微生物基因對豬糞便有較高的宿主特異性，以此為分子標記物建立的檢測方法能夠高靈敏、高特異性地判別和檢出污染源。因多型擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）在人類腸道中含量豐富且與宿主存在一定程度的共生，因此也具有指示宿主特異性的潛力。Xu Jian等[44]利用B.thetaiotaomicron中參與互作反應的α-1,6-甘露聚糖酶基因作為分子標記用于識別人類糞便污染。一些互作基因是從其他菌群（如大腸桿菌（Escherichia coli））中篩選出[45]。盡管類似于宿主-微生物互作的功能基因表現出較高的宿主特異性，但是相對16S rRNA基因而言互作基因含量相對較低，意味著該基因在MST應用過程中敏感性較差，有待進一步的研究。

有研究指出，致病性E.coli中存在一些毒基因與宿主特異性有關[26]，如腹瀉性E.coli的毒性基因，包括牛熱不穩定蛋白毒基因IIA（LTIIa）和豬熱穩定蛋白毒基因II（STII）、人致病性E.coli的熱穩定腸毒素基因（STIb）及屎腸球菌的表面蛋白基因（esp）等。利用上述毒基因為特異性分子標記能分別識別牛[30]、豬[31]及人類糞便[32]污染來源（表1）。也有部分研究利用腹瀉E.coli的毒基因建立PCR檢測方法以鑒定兔（ralG）、狗（papG III）、鳥（tsh）的糞便污染，但是針對這些宿主所建立的方法在特異性及靈敏性方面還需進一步提高（表1）。

除此之外，還有其他基因存在宿主糞便特異性，并可以作為分子標記進行相應的MST研究[46]。例如，Ram等[47]對β-葡萄糖醛縮酶基因（uidA）片段進行序列分析發現，其中一些等位基因對人類及鳥類糞便表現出一定的特異性，并以此基因作為分子標記開展了相應的微生物溯源研究。古生菌中的產甲烷桿菌也存在一些宿主特異性基因可用于微生物溯源，如基于人類特異性的史氏甲烷短桿菌中的nifH基因、反芻動物特異性的胃瘤甲烷短桿菌中的nifH基因及不能培養的豬糞便特異性產甲烷桿菌mcrA基因[48]（表1）。此外，因各個宿主的消化系統、基因型及飲食結構的不同，一些代謝相關基因也存在一定宿主特異性，然而由于技術問題，以此類基因為目標進行宿主糞便污染的研究相對較少。

2 基于特異性分子標記物的MST方法在食品鏈中的應用

2.1 基于特異性分子標記物的MST方法在食品淡水源中的應用

灌溉水可作為農業用水，從根本上污染食品原材料。已有研究從灌溉水及其沉積物中分離出多種糞便污染物及病原菌E.coli、沙門氏菌屬（Salmonellaspp.）、李斯特菌屬（Listeriaspp.）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）及假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）等[49]。在部分發展中國家，即便有相關法律規定未經嚴格處理的污水不可用于農業灌溉，但該現象仍十分普遍。因此，識別灌溉水中微生物污染源，對干預并治理污染，從而確保糧食和生鮮果蔬等食品原材料的質量安全有重要意義。Martellini等[50]利用線粒體作為分子標記的MST方法評估所研究地區的農田地表水受糞便污染情況，結果發現，該地區水體在一定程度上受到了人類和動物糞便的污染。García-Aljaro等[51]利用宿主特異性的擬桿菌分子標記建立MST方法，成功區分了人類和反芻動物糞便源，同時將該方法與水質監測模型結合，綜合湖中擬桿菌分子標記和病原體（病毒、隱性孢子）的濃度，對因水質污染產生的地方病和流行病發可能性進行了評估。Fan Lihua等[22]利用已建立豬糞便特異性分子1～38和3～53對長江三角洲地區水域進行污染調查，結果發現，部分水域存在糞便污染，且出現了如E.coliO157:H7，沙門氏菌屬和彎曲桿菌屬（Campylobacterspp.）等病原菌，同時表明，與傳統指示菌方法相比，以特異性分子1～38和3～53建立的MST方法能更好指示病原菌污染。類似地，Gomi等[52]利用腸道微生物E.coli中的宿主特異性基因（W_nqrC和W_clsA_2）作為分子標記，用于調查廢水微生物質量，結果發現，這2 種分子標記的檢測特異性達98.9%，檢測結果優于先前以人類腸道微生物E.coli為特異性分子標記物（E.coliH8和E.coliH12）得到的結果[53]。另外，使用未經處理的水源沖洗食品生產設備及接觸面也會造成食品污染。Prince-Guerra等[54]采用以擬桿菌16S rRNA為標記物的MST方法對操作人員經水洗滌和消毒后的手部微生物污染效果進行對比分析，結果發現，2 組操作人員受微生物污染的手部殘留特異性病原菌無顯著差異，即洗滌或消毒對糞便污染的干預效果基本一樣。

2.2 基于特異性分子標記物的MST方法在生鮮農產品中的應用

近幾十年來，越來越多的食源性疾病與最低限度加工的農產品有關。大多數與生鮮農產品相關的病原菌起源于腸道（糞便）污染，且從農場到餐桌鏈的任何環節中都有可能發生。目前關于基于特異性分子標記物的MST方法在生鮮農產品中的應用研究多集中在國外，國內幾乎處于空白。為調查果蔬類農產品受糞便污染情況，Ravaliya等[55]利用以擬桿菌16S rRNA基因建立的MST方法對生鮮果蔬中潛在的糞便污染進行識別及溯源，結果發現，在174 個樣本中，39%的通用擬桿菌標記物（AllBac）呈陽性，其中66%樣本來自哈密瓜農場、31%樣本來自番茄農場、18%樣本來自墨西哥胡椒農場。在68 個AllBac陽性樣本中，46%與人類糞便污染有關，與牛糞便無關；同時，該研究結果表明，擬桿菌屬標記可作為新鮮農產品生產中糞便污染的替代指標，進而用于確定一般污染和源自人類宿主的污染。隱孢子蟲可在多種脊椎動物宿主中引起腸胃炎，Ahlinder等[56]基于傳統疾病爆發調查方法與宏基因組分析方法相結合，研究萵苣中小隱孢子蟲污染情況和來源。結果表明，基于PCR分型的MST方法在2/3的樣本中檢測到了小隱孢子蟲，且結合MST技術結果認為種植過程中使用的污水是造成萵苣污染的重要來源。類似地，Lee等[57]將分別以人類特異性標記分子（HF183和gyrB）和豬（PF163）、雞（CP3-49）、牛（BoBac）等動物類特異性標記分子建立的MST方法用于識別生鮮果蔬中糞便污染，結果表明，所有real-time PCR檢測都能對受污染的生菜進行可靠檢測。該項研究對追溯生鮮果蔬中糞便污染的來源和改善農業操作行為起到重要作用。

研究證明很多乳源性病原菌，如彎曲桿菌屬、志賀大腸桿菌、李斯特產單胞菌、沙門氏菌屬、耶爾森氏菌等均出現在農場牛乳中[58]。Altalhi等[59]通過E.coli為指示菌以及從E.coli分離菌中篩選的功能性毒基因作為標記物分析沙特阿拉伯西部Taif地區原料乳來源的細菌質量和安全性，從而達到檢測糞大腸菌群和E.coli的自然污染情況的目的。雖然特定來源擬桿菌屬微生物源追蹤標記已被提議作為水體糞便污染評估的替代指標，但尚未被用于評估動物源性食品中糞便污染情況。為調查牛乳和含乳嬰幼兒食品受微生物污染的情況，Tsai等[60]利用特定來源的擬桿菌屬分析從肯尼亞地區部分供應商手中取得的394 份樣品，結果發現，護理人員手工準備的乳中多次檢出標記物，而乳制品中標記物檢出頻率較低。此外，基于擬桿菌屬的MST技術在檢測乳制品中腸道病原菌方面的敏感性低于傳統基于腸桿菌科的檢測方法。盡管基于擬桿菌屬的MST技術能提供一些關于食品糞便微生物污染的信息，但卻無法預測腸道病原菌污染來源。

2.3 基于特異性分子標記物的MST方法在海產品及其養殖環境中的應用

水產養殖環境對水產品質量與安全有重要影響。然而，目前全球范圍的非點源污染（主要指人類和動物排泄物）已成為影響水體環境質量、破壞海洋生態以及導致水產品重大安全隱患的主要原因。美國約13%的天然水資源中能檢測到來自人類和動物糞便的大量腸道指示菌污染，每年僅由于腸道病原引起的水產品食物中毒事件占食源性疾病的10%以上；而我國僅來自畜禽養殖糞便的污染就占水體污染總量的53%，因腸道致病菌（副溶血性弧菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、彎曲桿菌、甲肝病毒、諾如病毒等）引起的水產品食物中毒事件更是屢見不鮮[60-61]。為評估水產養殖環境質量，Liu Rulong等[62]采用限制性片段多態性分析方法將8 個不同宿主（人、牛、豬、馬、貓、狗、兔子、鼠）的腸道擬桿菌群16S rRNA基因序列分成6 個宿主特異性末端限制性片段（terminal restriction fragments，TRFs），利用這6 個TRFs建立MST方法，并將其用于香港地區海水中人、牛及豬等糞便污染的調查。結果表明，這6 個TRFs能作為宿主特異性分子標記判別污染來源。此外，近年來采用宿主特異性分子標記方法對水體和軟體貝類中人源和動物源糞便進行區分的研究還有很多[63-65]，這些研究一般為基于擬桿菌16S rRNA基因、F特異性RNA噬菌體（F-specific RNA bacteriophages，F+RNA噬菌體）、F+RNA大腸桿菌噬菌體所建立的方法。例如，Gourmelon等[27]采用基于擬桿菌16S rRNA基因的real-time PCR方法和基于特異性F+噬菌體基因分型2 種方法檢測海水和貝類中的糞便污染，結果發現，這2 種方法具有較高的特異性和檢測靈敏度，是檢測沿海地區水域和貝類中糞便污染的有效手段之一。Gyawali等[23]利用3 種特異性分子標記物，包括交叉裝配噬菌體（crAssphage）、F+RNA噬菌體基因組II（F+RNA噬菌體GII）和胡椒輕斑駁病毒（PMMoV）對牡蠣和貽貝中的F+RNA噬菌體和諾如病毒污染情況進行調查，發現crAssphage和PMMoV能準確、靈敏地預測諾如病毒污染，然而，相比crAssphage和PMMoV，F+RNA噬菌體GII具有更高的預測特異性。因此，該團隊認為crAssphage和F+RNA噬菌體GII結合分析可以對貝類中人糞便和諾如病毒的污染提供可靠的預測。目前還有一些研究是以人和動物腸道病毒基因為標記物進行貝類收獲地區糞便污染的檢測[24,65]。

3 結論

MST技術是一種能在環境或食品樣品中高精度判別不同宿主污染源的糞便指示菌或食源性病原菌的工具，尚處于發展階段。目前MST方法已得到廣泛應用，如用于制定相關法規、管理污染及評估風險。這些應用有助于減少與食品和水質有關的疾病發生，并改善社會公共健康。然而，盡管許多MST方法在實際應用過程中取得了良好的效果，卻仍未找到一種最有效的方法，其面臨的共同挑戰大致可以分為：1）方法本身的局限性，例如，只在一定的地理范圍內對污染樣品具有較高靈敏性和特異性；2）方法的實際應用性，如稀釋樣品的靈敏性低、存在抑制物、環境樣品中DNA擴增效率低；3）綜合信息缺乏，如關于生物體的生態學知識、特異性標記物在環境中持續時間及環境中糞便指示菌與病原菌的關聯性等。

為克服以上局限，接下來的微生物溯源研究應更加注重雜交技術、基因測序技術及其他技術之間的相互結合，篩選并開發出具有靈敏性高、特異性強、無交叉反應性等特點的宿主特異性標記物，保證MST技術在實際應用中結果的精確有效。此外，目前大部分MST應用研究均利用單一的宿主特異性標記物對水體或食品鏈中特定物種進行污染識別和溯源，所建立方法的靈敏度和特異性較低。聯合使用多種宿主特異性標記物構建多因子預測模型可明顯提高檢測的靈敏性和特異性，因此構建高精確度、可以用來判別不同宿主污染來源的預測模型可成為今后研究的重點。