祛濕健骨方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化能力的促進(jìn)作用研究

劉闐生, 熱孜亞·艾買提, 阿衣努爾·熱合曼, 陳媛鑫, 卡依沙爾, 阿衣努爾·買提斯迪克

(1新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院, 烏魯木齊 830017; 2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院繼續(xù)教育部, 四川 瀘州 646000;3南京中醫(yī)藥大學(xué)黨委學(xué)生工作部, 南京 210029)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)被認(rèn)為是以骨量低和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征的進(jìn)行性系統(tǒng)性骨骼疾病[1],常伴有骨量低、骨脆性增加、骨折等癥狀[2]。伴隨著人口老齡化的加重,骨質(zhì)疏松癥的患病率也顯著增加,因此預(yù)防及治療手段當(dāng)務(wù)之急,而我國(guó)對(duì)骨質(zhì)疏松的研究仍存在較大缺口[3]。正常的骨內(nèi)環(huán)境是成骨細(xì)胞的骨形成作用與破骨細(xì)胞的骨吸收作用處于平衡狀態(tài),以此來(lái)保持正常的骨穩(wěn)態(tài)[4];而骨穩(wěn)態(tài)的破壞被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病原因之一。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)作為成骨細(xì)胞成熟的關(guān)鍵蛋白,可以通過(guò)調(diào)節(jié)骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix,OSX)的表達(dá),以達(dá)到誘導(dǎo)前成骨細(xì)胞成骨分化的目的[5-6]。糖皮質(zhì)激素具有抗炎及免疫抑制活性,被廣泛應(yīng)用于臨床治療;同時(shí),有研究顯示糖皮質(zhì)激素對(duì)成骨細(xì)胞的成骨能力與增殖能力具有抑制作用,長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素也是造成骨質(zhì)疏松癥的重要原因之一[7]。作為使用較為普遍的糖皮質(zhì)激素,地塞米松具有抑制成骨細(xì)胞增殖的作用[8]。

本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)祛濕健骨方具有促進(jìn)骨形成、減少骨吸收的作用,同時(shí)能夠改善血清雌二醇、骨鈣素、抗酒石酸性磷酸酶等骨代謝指標(biāo)及骨生物力學(xué)性能的紊亂狀態(tài),有效提高骨密度[9],但該方未有分子層面的相關(guān)研究。本研究對(duì)祛濕健骨方分子層面的作用機(jī)制進(jìn)行研究,利用地塞米松對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨能力的抑制作用,使用地塞米松建立MC3T3-E1細(xì)胞激素性骨質(zhì)疏松癥模型,并通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中RUNX2、OSX蛋白的表達(dá)水平,探討祛濕健骨方對(duì)激素性骨質(zhì)疏松癥的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑MC3T3-E1細(xì)胞購(gòu)自武漢普賽諾生命科技有限公司(CL-0378);地塞米松購(gòu)自Sigma公司;CCK-8試劑盒、ALP檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、RIPA(強(qiáng))裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;RUNX2(A11753)、OSX(A18699)、GAPDH(A19056)抗體購(gòu)自愛(ài)博泰克公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基配置 用完全培養(yǎng)基溶解祛濕健骨方[9]內(nèi)藥物,配成濃度為50 mg/mL 的母液,然后微孔過(guò)濾,-20℃長(zhǎng)期保存。加藥時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配,用 MEM-ɑ完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素溶液) 進(jìn)行稀釋, 分別配成0.005、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL濃度。

1.2.2 CCK-8檢測(cè) 細(xì)胞增殖各處理組細(xì)胞消化后制成混懸液,經(jīng)離心,棄上清液,加入新完培吹打均勻并計(jì)數(shù),均勻分布于96孔板(每孔200 μL),調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)量為1×104個(gè)。待細(xì)胞貼壁后,棄去原有培養(yǎng)基,再加入含藥培養(yǎng)基進(jìn)行干預(yù)。48 h后加入CCK-8溶液,比例為1/10(即 200 μL培養(yǎng)液加入20 μL檢測(cè)液;)在孵育1h后,酶標(biāo)儀讀板,CCK-8檢測(cè)讀取OD450數(shù)據(jù)。增殖率計(jì)算公式=(實(shí)驗(yàn)組OD值均值÷對(duì)照組OD值均值)×100%。

1.2.3 細(xì)胞分組及造模 借助地塞米松對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨能力抑制的特性,使用地塞米松干預(yù)細(xì)胞以創(chuàng)造MC3T3-E1細(xì)胞激素性骨質(zhì)疏松的環(huán)境。新6孔板明膠包被30 min,回收明膠,待板干后,將MC3T3-E1細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,鋪于6孔板上,分為對(duì)照組(不使用地塞米松與祛濕健骨方干預(yù))、地塞米松組(1 μmol/L地塞米松處理細(xì)胞48 h)、祛濕健骨方低、中、高濃度組(分別使用0.1、0.2、0.4 mg/mL的祛濕健骨方+1 μmol/L地塞米松共同處理)干預(yù)48 h后,更換成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)15 d,每隔3 d換液培養(yǎng)[10]。

1.2.4 檢測(cè)ALP表達(dá)水平 收集培養(yǎng)處理15 d后的MC3T3-E1細(xì)胞,加入RIPA(強(qiáng))裂解液,使細(xì)胞裂解并釋放細(xì)胞內(nèi)的成分。低溫離心機(jī)12 000 r/min離心10 min,仔細(xì)收集上清。使用堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)試劑盒檢測(cè) ALP 的表達(dá)水平。

1.2.5 檢測(cè)RUNX2,OSX的蛋白表達(dá) 收集各組MC3T3-E1細(xì)胞,根據(jù)說(shuō)明書加入適量RIPA裂解液,低溫離心機(jī)12 000 r/min 離心10 min,取上清液,用BCA檢測(cè)各組蛋白濃度。配平各組蛋白濃度,做變性處理。后取適量蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn),經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜后,分別加入RUNX2、OSX、GAPDH抗體4℃孵育過(guò)夜,洗膜后,加入二抗室溫下孵育1 h,加入顯色劑,在曝光儀下曝光。結(jié)果采用ImageJ軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 祛濕健骨方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖作用影響對(duì)比對(duì)照組,地塞米松組細(xì)胞活性降低;經(jīng)祛濕健骨方含藥培養(yǎng)基干預(yù)48 h后的MC3T3-E1細(xì)胞,活性明顯升高, 按藥物濃度等比增長(zhǎng), 濃度大于0.05 mg/mL時(shí)尤為明顯,見(jiàn)圖1。經(jīng)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比,藥物篩選出低濃度(0.1 mg/mL)、中濃度(0.2 mg/mL)、高濃度(0.4 mg/mL)3個(gè)最大存活率濃度。

注： A, 對(duì)照組; B, 地塞米松組; C,0.005 mg/mL濃度藥物; D, 0.025 mg/mL濃度藥物; E, 0.05 mg/mL濃度藥物; F, 0.1 mg/mL濃度藥物; G, 0.2 mg/mL濃度藥物; H, 0.4 mg/mL濃度藥物。

2.2 地塞米松+祛濕健骨方干預(yù)下MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的變化對(duì)照組、地塞米松組、低劑量組、中劑量組、 高劑量組OD值分別為0.170±0.012、 0.057±0.001、 0.062±0.002、 0.074±0.006、 0.109±0.016。與對(duì)照組相比,地塞米松組、低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞ALP活性均降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與地塞米松組相比,低劑量組、中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);高劑量組細(xì)胞ALP活性升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 MC3T3-E1細(xì)胞中RUNX2、OSX蛋白的表達(dá)

2.3 地塞米松+祛濕健骨方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞RUNX2、OSX蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較,中劑量組、低劑量組、地塞米松組細(xì)胞的RUNX2、OSX蛋白表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高劑量組細(xì)胞OSX和RUNX2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與地塞米松組比較,高劑量組OSX和RUNX2蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1,圖2、3、4。

圖2 OSX和RUNX2蛋白在MC3T3-E1細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 RUNX2蛋白在MC3T3-E1細(xì)胞中的表達(dá)

圖4 OSX蛋白在MC3T3-E1細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

隨著OP發(fā)病率的日益增高,對(duì)OP的預(yù)防和治療迫在眉睫。成骨細(xì)胞被抑制,破骨細(xì)胞增殖導(dǎo)致的骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)紊亂與OP的發(fā)生密切聯(lián)系[11]。糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡是誘發(fā)骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素;促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,以此改善激素性O(shè)P成為目前研究的熱點(diǎn)[12]。地塞米松是較為常用的糖皮質(zhì)激素,有研究表明,地塞米松能夠抑制成骨細(xì)胞的成骨能力[13]。ALP參與骨形成作用,是成骨細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志物[14]。本研究使用地塞米松干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)地塞米松組細(xì)胞ALP活性相較于對(duì)照組明顯降低;而藥物+地塞米松共同處理的細(xì)胞ALP活性較地塞米松組明顯升高,且隨藥物濃度的增高呈正相關(guān)趨勢(shì),證實(shí)了祛濕健骨方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化能力具有促進(jìn)作用。

RUNX2在成骨細(xì)胞成熟的過(guò)程中起重要作用,它能調(diào)控多種因子(如OSX、FGFR2、FGFR3等),以此誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化[15];OSX作為RUNX2的下游蛋白,可一同影響成骨細(xì)胞的分化[16]。本研究中,祛濕健骨方與地塞米松共同干預(yù)的細(xì)胞,其OSX與RUNX2的表達(dá)高于地塞米松組的細(xì)胞,可以推測(cè)出祛濕健骨方通過(guò)提高RUNX2、OSX蛋白的表達(dá)水平,促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成與成熟。

目前針對(duì)OP的治療以西藥為主[17]。近年來(lái),中醫(yī)藥的研究顯示出其對(duì)防治OP的獨(dú)到之處。實(shí)驗(yàn)證明,固本活血壯骨顆粒可拮抗糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥,減少骨質(zhì)丟失[18]。淫羊藿也被證實(shí)擁有增殖成骨細(xì)胞的能力[19]。地塞米松在骨內(nèi)環(huán)境中致使成骨細(xì)胞分化能力被抑制,成骨功能受損明顯,而祛濕健骨方可能通過(guò)提高RUNX2蛋白的表達(dá),從而調(diào)控OSX表達(dá)提高,誘導(dǎo)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化,有效緩解地塞米松造成的成骨細(xì)胞損傷。本研究證實(shí)了祛濕健骨方對(duì)成骨細(xì)胞分化能力具有促進(jìn)作用,推測(cè)其可能通過(guò)提升RUNX2和OSX蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟。但本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象僅限于MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化能力;后續(xù)研究中,可增加祛濕健骨方對(duì)破骨細(xì)胞分化能力的探索,以期為祛濕健骨方防治OP提供理論依據(jù)。