CircRNA_000121在伴有頸部淋巴結轉移的甲狀腺微小乳頭狀癌中的表達

白 超, 楊雯雯, 祁光偉, 楊柳雨, 羅 軍, 劉 濤

(新疆醫科大學第一附屬醫院1血管甲狀腺外科, 2干部保健中心綜合內二科, 烏魯木齊 830054;新疆醫科大學3公共衛生學院, 4公共衛生與預防醫學博士后科研流動站, 烏魯木齊 830017)

甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是一種起源于甲狀腺濾泡上皮細胞的惡性腫瘤。近幾十年來,PTC的發病率在全球急劇上升,尤其是病變直徑≤1 cm的甲狀腺微小乳頭狀癌(Papillary thyroid microcarcinoma,PTMC)[1]。部分學者認為,PTMC患者病灶生長緩慢,甚至可以帶癌生存,對該類患者可進行隨訪觀察,但也有一部分學者認為,不是所有的PTMC都是惰性,有相當一部分的PTMC很早就發生局部侵犯、頸部淋巴結轉移,甚至遠處轉移等現象,威脅患者生命[1]。目前,臨床工作中術前的常規檢查無法區分甲狀腺腫瘤的侵襲能力,亟需在避免過度治療和對侵襲性強的腫瘤及時手術中尋找一個平衡點[2-4],致使判斷甲狀腺腫瘤的侵襲性變得至關重要。近年來,隨著高通量測序和生物信息技術的發展,學者們發現一系列非編碼RNA[5]。環狀RNA(Circular RNA,circRNA)具有高度保守性、組織時序性和疾病特異性,是一種天然的生物學標記物[6],它的產生受特定順式調節元件和反式作用因子的調控[7]。有研究表明,CircRNA與胰腺癌[8]、膀胱癌[9]、胃癌[10]和肺癌[11]等腫瘤的發生密切相關,其在疾病的治療方面也取得了一定的進展[12]。CircRNA具有吸附miRNA的作用,miRNA作用于mRNA,最終形成CircRNA/miRNA/mRNA信號通路,調控疾病的發生與發展[13-14]。近年來,也有甲狀腺癌與circRNA相關的文獻報道[15-16]。本課題前期研究發現,circRNA_000121在PTMC伴有頸部淋巴結轉移(中央區)[ PTMC(L)]中呈高表達,并各選取10例標本進行qRT-PCR驗證發現,circRNA_000121有望成為PTMC發生頸部淋巴結轉移的生物學標記物。本研究旨在通過qRT-PCR檢測PTMC血標本、組織標本的circRNA、miRNA和mRNA,分析circRNA_000121在PTMC伴有頸部淋巴結轉移中的作用,為臨床手術提供支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2022年1-4月在新疆醫科大學第一附屬醫院血管甲狀腺外科住院的60例患者為研究對象。其中PTMC伴有頸部淋巴結轉移(中央區)[PTMC(L)組]患者30例,PTMC不伴有淋巴結轉移(PTMC組)患者30例。收集所有患者術前外周血標本、術中甲狀腺癌組織及一般資料。納入標準:(1)經病理證實為病灶直徑≤1 cm的PTMC;(2)年齡>18歲;(3)首次手術治療者。排除標準:(1)有明確甲狀腺病史的患者;(2)有甲狀腺手術史者;(3)術前口服甲狀腺藥物治療者;(4)妊娠期患者;(5)肝腎功能異常患者;(6)其他惡性腫瘤患者。本研究已通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審批(審批號:S20211106-01)。已充分告知患者及家屬相關情況,并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(Low Rox Plus)(美國Yeasen公司,批號:11202ES08);HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(批號:R323-01)、Ribonuclease Inhibitor(貨號:R301-03)、M-MLV Reverse Transcriptase(批號:R011-01)均購自美國Vazyme公司;dNTP Mix (10 mM each)(美國Fermentas公司,批號:R0192);One-Step gDNA Removal and cDNA(美國Transgene公司,批號:AT311-03);Q-PCR儀器(美國ABI公司,貨號:QuantStudio 5);PCR儀(美國BIO-RAD公司,貨號:mycycler);渦旋儀(貨號:MX-F)、掌上離心機(貨號:D1008E)購自美國SCILOGEX公司;微孔板振蕩器(貨號:MIX-1500)、微孔板迷你離心機(貨號:Mini-P25)購自杭州米歐儀器有限公司;GraphPad Prism軟件(美國CA公司,版本號:8.0)。

1.3 實驗方法采用反轉錄試劑盒在thermocycle儀器上進行cDNA合成,反轉錄條件:42℃,5 min;37℃,15 min;85℃,5 s。在ABI Quant Studio 5儀器上進行qPCR反應,95℃預變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火延伸1 min,共進行40個循環。每個樣品進行3次技術重復。以GAPDH為內參基因,進行標準化,使用RQ=2-ΔΔCt計算每個轉錄本mRNA的相對表達量。引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成,見表1。

表1 引物設計

2 結果

2.1 兩組患者一般資料的比較PTMC組和PTMC(L)組患者在性別、年齡方面的差異均無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 兩組患者一般資料的比較

2.2 兩組患者circRNA_000121、miRNA-146b-3p及MMP2的表達水平比較qRT-PCR結果顯示,與PTMC組患者比較,PTMC(L)組患者外周血和組織標本中circRNA_000121、MMP2呈高表達,miRNA-146b-3p呈低表達,差異有統計學意義(P均<0.05),見表3。

表3 circRNA_000121、miRNA-146b-3p和MMP2表達水平比較

2.3 兩組患者circRNA_000121對PTMC發生頸部淋巴結轉移的預測經ROC分析結果顯示,外周血曲線下面積(AUC)為0.964,置信區間(95%CI)0.915～1.000,靈敏度0.933,特異度1.000,約登指數0.933。組織標本AUC為0.943,置信區間(95%CI)0.874～1.000,靈敏度0.900,特異度0.967,約登指數0.867,見圖1。

外周血

2.4 circRNA_000121、miRNA-146b-3p、MMP2與PTMC發生淋巴結轉移的相關性分析二分類Logistic回歸分析結果顯示,circRNA_000121、miRNA-146b-3p、MMP2在外周血和癌組織中的表達均與淋巴結轉移相關(P<0.05),見表4。

表4 外周血與PTMC組織中circRNA_000121、miRNA-146b-3p和MMP2表達水平的Logistic回歸分析

3 討論

本課題組在前期研究中納入3例PTMC和PTMC(L)患者術前外周血標本,通過circRNA芯片檢測,篩選出差異顯著且差異倍數>2的circRNA,并在原實驗標本上進行qRT-PCR驗證。本研究qRT-PCR結果顯示,與PTMC患者比較,circRNA_000121和MMP2在PTMC(L)患者的外周血和甲狀腺癌組織的表達升高,miRNA-146b-3p在PTMC(L)患者的外周血和甲狀腺癌組織的表達降低,組織與外周血標本中表達一致。提示PTMC患者可在外周血標本中篩查circRNA_000121是否發生頸部淋巴結轉移。

本研究初步驗證了circRNA_000121有望成為甲狀腺腫瘤侵襲性的標志物,ROC曲線檢測說明外周血中其表達水平可初步判斷PTMC的侵襲性。實驗結果表明,miR-146b-3p在PTMC(L)呈低表達,下游的MMP2在PTMC(L)呈高表達狀態。二分類Logistic回歸分析結果顯示,外周血和甲狀腺癌標本中circRNA_000121、miRNA-146b-3p和MMP2表達水平與PTMC發生頸部淋巴結轉移有相關性。說明上述分子可作為PTMC發生頸部淋巴結轉移的明星分子,為臨床提供指導。然而,關于miR-146b-3p及其下游靶基因的研究很少。

有研究顯示,基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)在惡性腫瘤轉移過程中發揮作用,是癌癥的治療靶點之一[17]。MMPs屬于鋅依賴性內肽酶家族,能夠降解細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)的成分。MMPs在ECM重塑中具有組織形態發生、生長、組織修復和血管生成等作用,參與細胞增殖、遷移、分化、血管生成和凋亡等生理環節[18]。有研究顯示,在多種癌癥亞型中,MMP的失調在腫瘤生長和轉移過程中具有雙重作用,在侵襲性癌癥中具有治療潛力,其表達譜是多種人類疾病的一種新的診斷和預后生物標志物[19]。因此,調控MMP2的表達水平或其功能可能是包括癌癥在內的各種疾病的潛在治療靶點。Bai等[20]研究發現,circRNA_ 004183在PTMC(L)血標本中呈高表達,后期小樣本驗證亦表明circRNA_ 004183可作為PTMC發生頸部淋巴結轉移的明星分子,為PTMC發生頸部淋巴結轉移分子機制研究提供支持。Dai等[21]通過體內、外實驗研究circAGTPBP1在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)進展中的生物學功能后發現,在PTC組織和細胞中,circAGTPBP1呈上調,其表達與腫瘤大小、淋巴結轉移和臨床分期呈正相關,敲除circAGTPBP1可抑制PTC細胞系的遷移、侵襲和轉移,抑制體內PTC的生長。表明circAGTPBP1可能是PTC腫瘤的促進因子,可以成為PTC的潛在治療靶點。

綜上所述,PTMC(L)組患者外周血和組織標本中circRNA_000121均呈高表達,可能是其下游的miRNA與mRNA。本研究不足之處是未進行相關細胞表型實驗、雙熒光素酶實驗等。后期將開展相關研究,明確PTMC發生頸部淋巴結轉移的信號通路,為PTMC發生頸部淋巴結轉移及治療靶點提供分子機制的支持。