PIK/Akt/mTOR信號通路在肺腺癌不同EGFR突變狀態(tài)中的臨床相關(guān)研究與預(yù)測價值

擺惠芹, 加孜那·托哈依

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與呼吸危重癥中心, 烏魯木齊 830054)

近年來,肺腺癌已成為全球范圍內(nèi)最為常見的腫瘤之一[1]。早期診斷和治療手段的不斷改進(jìn)雖然取得了一定的成效,但仍然存在著一系列挑戰(zhàn),特別是在一些特定亞型肺腺癌的治療方面。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)突變型肺腺癌是其中最為突出的亞型之一,其良好的治療反應(yīng)性使其成為靶向治療的重點(diǎn)[2-4]。部分患者在接受EGFR抑制劑治療后通常會出現(xiàn)耐藥性,而EGFR點(diǎn)突變類型與酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的藥效密切相關(guān),研究表明EGFR的T790M突變是一、二代EGF-TKI療效下降的主要原因[5],然而,隨著EGFR T790M抑制劑的用量不斷增加,療效下降的現(xiàn)象逐漸出現(xiàn),研究表明其耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣[6],這可能與PIK/Akt/mTOR信號通路的激活有關(guān)[7]。因此,研究人員正在積極開發(fā)聯(lián)合治療策略,包括抑制PIK/Akt/mTOR信號通路以克服治療抵抗[8]。PIK/Akt/mTOR信號通路的異常活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲能力增強(qiáng)有關(guān)[9-10]。然而在EGFR突變型肺腺癌中,PIK/Akt/mTOR信號通路與EGFR基因突變之間的相互作用目前眾多學(xué)者說法不一。本文旨在探討PIK/Akt/mTOR信號通路與肺腺癌EGFR不同突變狀態(tài)之間的相關(guān)性以及PIK/Akt/mTOR信號通路與肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。通過深入研究PIK/Akt/mTOR信號通路與EGFR突變型肺腺癌之間的關(guān)系將有助于更好地了解肺腺癌的發(fā)展機(jī)制以及開發(fā)更加精準(zhǔn)和有效的治療策略,為患者提供更好的臨床治療效果并且提高生存質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 研究對象本研究為回顧性研究,收集2010-2019年在本院接受外科手術(shù)且經(jīng)病理證實(shí)的肺腺癌患者的手術(shù)組織標(biāo)本共342例,二代測序(NGS)法進(jìn)行檢測,根據(jù)EGFR有無突變分為陽性組與陰性組,其次將磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶催化亞基α(PIK3CA)、PIK3CB、磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3CG)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)相關(guān)基因表達(dá)根據(jù)有無突變分為陽性組與陰性組,對其進(jìn)行EGFR基因檢測及PIK/Akt/mTOR相關(guān)信號通路相關(guān)基因檢測。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者知情同意,瀏覽已故患者的病例資料,需經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)(20190531-03);(2)外科手術(shù)標(biāo)本病理診斷為肺腺癌,且由2名以上病理科醫(yī)師復(fù)核,肺癌診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一按最新指南;(3)既往未接受任何抗腫瘤治療(包括手術(shù)、放療、化療、靶向藥物治療或其他抗腫瘤治療等)的初治患者;(4)并由NGS基因檢測法行EGFR基因檢測及PIK/Akt/mTOR相關(guān)信號通路相關(guān)檢測。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)曾患肺癌或其他惡性腫瘤;(2)重復(fù)治療的患者,僅將第一次的就診病例納入;(3)缺乏完整臨床信息的患者;(4)NGS方法行基因檢測失敗而未能檢測出基因結(jié)果。

1.2 方法

1.2.1 樣本 石蠟包埋手術(shù)切除的樣本,使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)行切片處理,之后HE染色,由高年資病理學(xué)醫(yī)師光學(xué)顯微鏡下觀察選取腫瘤含量超過80%的癌組織蠟塊標(biāo)本。

1.2.2 制片 使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)進(jìn)行石蠟樣本切片,石蠟切片在40℃水浴缸上展平后,移到載玻片上,同時置入烤箱中烤干。

1.2.3 基因檢測 標(biāo)本均送至諾禾基因公司,由諾禾基因公司實(shí)施基因檢測,檢測流程如下:(1)使用QIAGEN FFPE提取試劑提取福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本中DNA;(2)DNA電泳檢測和定量:DNA質(zhì)量的提取用1%瓊脂糖凝膠電泳法,DNA的濃度檢測使用Qubit,DNA總量應(yīng)不少于150 ng;DNA降解程度≥C級;(3)酶切片段化DNA;(4)末端修復(fù)和加A尾后進(jìn)行接頭連接;(5)磁珠純化連接產(chǎn)物;(6)文庫擴(kuò)增;(7)擴(kuò)增產(chǎn)物純化;(8)雜交捕獲;(9)上機(jī)測序:選用Ⅰllumina測序策略為Paired-End 2X150bp的測序試劑和Nextseq500/50或NovaSeq測序儀,每個樣品文庫檢測數(shù)據(jù)量不低于13 Gb。

1.2.4 質(zhì)量控制 嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)選擇研究對象,收集的數(shù)據(jù)由2名以上的人員復(fù)查核對,統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)及診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS26.0軟件包進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示。當(dāng)總數(shù)≥40同時理論頻數(shù)>5采用χ2檢驗(yàn),當(dāng)總數(shù)<40或理論頻數(shù)<5采用Fisher精確概率法分析;采用Spearman秩相關(guān)分析各驅(qū)動基因突變狀態(tài)關(guān)聯(lián)性,P值均基于雙向假設(shè)檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對于EGFR基因突變的影響因素使用多元Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變在肺腺癌患者不同臨床病理特征中的分布EGFR陽性組與EGFR陰性組患者在年齡上的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),60歲以下患者較60歲以上患者更易發(fā)生EGFR突變;肺腺癌患者不同組織分型及分化程度在EGFR陽性組與陰性組中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見表1。

表1 EGFR突變狀態(tài)與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系/例(%)

2.2 EGFR不同突變位點(diǎn)突變頻率分布情況此次共檢測出EGFR突變155例,突變頻率為45.3%,其中19exon 60例(38.7%), 21exon 72例(46.5%),20exon 6例(3.9%),其他位點(diǎn)17例(10.9%)。

2.3 PIK/Akt/mTOR信號通路在342例肺腺癌中的分布情況在342例肺腺癌患者中,PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、Akt、mTOR突變分布狀況如下,其中PIK3CG的突變比率最高,為49.4%,見表2。

表2 PIK/Akt/mTOR信號通路在342例肺腺癌中的分布情況/例

2.4 PIK/Akt/mTOR信號通路與肺腺癌患者EGFR不同突變狀態(tài)表達(dá)的相關(guān)性PIK3CA、PIK3CG與EGFR不同突變狀態(tài)下的表達(dá)具有相關(guān)性(P<0.05),即PIK3CA、PIK3CG表達(dá)陽性的患者EGFR突變頻率更高,見表3。

表3 PIK/Akt/mTOR信號通路與肺腺癌患者EGFR不同突變狀態(tài)的相關(guān)性分析

2.5 PIK信號通路在肺腺癌患者EGFR不同突變位點(diǎn)表達(dá)的差異性EGFR突變中最常見的位點(diǎn)位于19exon及21exon,PIK3CA、PIK3CB和PIK3CG在肺腺癌患者EGFR不同突變位點(diǎn)的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4。

表4 PIK信號通路在EGFR不同突變位點(diǎn)中的差異性分析/例(%)

2.6 PIK信號通路與T790M不同突變狀態(tài)表達(dá)的相關(guān)性PIK3CA表達(dá)與T790M突變狀態(tài)具有相關(guān)性(P<0.05),說明PIK3CA表達(dá)陽性患者更易誘導(dǎo)T790M耐藥突變,見表5。

表5 PIK信號通路與T790M不同突變狀態(tài)表達(dá)的相關(guān)性

2.7 PIK/Akt/mTOR信號通路的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性PIK3CB和mTOR在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PIK3CB、mTOR表達(dá)陽性的患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,見表6。

表6 PIK/Akt/mTOR信號通路的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

2.8 EGFR突變預(yù)測因素的多因素分析以單因素分析中有差異指標(biāo)以及目前相關(guān)研究中較多提示有意義的指標(biāo)為自變量,患者EGFR突變狀況為因變量,進(jìn)行多元Logistic回歸分析影響EGFR突變狀態(tài)的影響因素。結(jié)果顯示年齡(P=0.036,OR=3.680,95%CI:0.398～0.970)、 PIK3CA(P=0.042,OR=4.136, 95%CI:1.034～6.237)、PIK3CG(P=0.012、OR=6.366、95%CI:1.133～2.079)對EGFR突變陽性預(yù)測價值較好,年齡、PIK3CA、PIK3CG表達(dá)水平是預(yù)測EGFR突變的獨(dú)立危險因素(P<0.05),見表7。

表7 EGFR突變預(yù)測因素的多元Logistic回歸分析

3 討論

有研究表明,近50%的亞洲晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者存在EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的體細(xì)胞激活突變[11]。本研究對342例肺腺癌患者進(jìn)行二代基因檢測,其中共有155例患者發(fā)生EGFR突變,突變頻率為45.3%。此次研究的342例肺腺癌患者中,60歲以下患者較60歲以上患者更易發(fā)生EGFR突變,與相關(guān)研究中EGFR突變與年齡無相關(guān)性[12]結(jié)果不一致,考慮與檢測方式的不同有關(guān)。有研究顯示,EGFR突變率為50.84%,其中21外顯子占26.02%,19外顯子占20.24%,20外顯子占2.17%,18外顯子占0.24%,雙突變占2.17%,外顯子19和21占總突變的92.89%,為最主要的突變位點(diǎn)[13]。在本研究中,exon19號位點(diǎn)突變共有60例(38.7%)、exon21號位點(diǎn)突變共有72例(46.5%)、 exon20號位點(diǎn)突變共有6例(3.9%)。本次研究的342例肺腺癌患者中,PIK3CG突變共有169例(49.4%),PIK3CA突變共有23例(6.7%)。張欣[14]研究顯示,PIK3CA占所有納入肺癌患者的5.88%,在3.3%的肺腺癌患者中檢測到PIK3CA突變。

PIK/Akt/mTOR是一條重要的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路,它在調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、代謝等多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。本研究結(jié)果顯示,PIK3CA、PIK3CG陽性患者更易發(fā)生EGFR突變(P<0.05)。有研究表明,與其他單獨(dú)的致癌基因相比,PIK3CA基因突變單獨(dú)存在時致癌性較弱,通常是與其他致癌基因突變共同存在,其中最常見的是EGFR基因突變[16],這與本文論證觀點(diǎn)一致。

多重耐藥性(MDR)會阻礙化療藥物及靶向藥物的療效,通常導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在耐藥患者中,先天性和獲得性耐藥各占50%左右[17],T790M突變是EGFR最常見的先天性耐藥機(jī)制[18]。本研究顯示,PIK3CA表達(dá)陽性患者更易發(fā)生T790M耐藥突變(P<0.05)。Edgar等[19]證實(shí)發(fā)生PIK3CA突變的細(xì)胞是由過度激活的PI3K/Akt/mTOR信號通路實(shí)現(xiàn)的,由此導(dǎo)致對PI3K抑制劑產(chǎn)生耐藥性。同時也有研究表明,在接受奧希替尼治療的患者中也發(fā)現(xiàn)PIK3CA的突變,PIK3CA突變可能導(dǎo)致肺癌患者對奧希替尼耐藥[4],因此PIK3CA信號通路的突變可能會誘導(dǎo)肺癌患者對EGFR-TKI的耐藥[20-21],但具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示,PIK3CB、mTOR表達(dá)陽性的患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05),YANG等[22]和唐代[23]提出PIK3CB蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),與沒有PIK3CB突變的患者相比,發(fā)生PIK3CB突變的患者總生存期(OS)時間更短[24]。研究表明,在NSCLC患者中,PIK3CB mRNA的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、不良預(yù)后相關(guān)[25]。也有研究表明mTOR活性的存在也可能是早期非小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后因素,免疫組織化學(xué)檢測的mTOR表達(dá)增加與低生存率有關(guān)[26]。本研究結(jié)果顯示,年齡、PIK3CA和PIK3CG對EGFR突變狀態(tài)預(yù)測價值好,年齡是EGFR突變狀態(tài)的危險因素。有研究發(fā)現(xiàn),在肺癌中PIK3CA通常與EGFR突變同時發(fā)生,EGFR與PIK3CA同時發(fā)生突變的肺腺癌患者的無進(jìn)展生存時間(PFS)比單個EGFR突變的患者短,PIK3CA突變因此被確定為PFS差和OS較短的預(yù)后因素[27]。在Wu等[28]的一項(xiàng)研究中,PIK3CG突變被認(rèn)為是肺腺癌患者有利的預(yù)后因素。存在的局限性和不足:本研究是回顧性研究,存在信息收集的選擇性偏倚;由于缺乏對EGFR突變肺腺癌患者后期治療和復(fù)查隨訪數(shù)據(jù),本研究無法對EGFR及PIK基因與預(yù)后相關(guān)的評估進(jìn)行具體研究。