200例地中海貧血第三代測序檢測及結果分析

馬金花,黃 佩,吳柳松,羅南都,何志旭,陳 艷,4

(1.遵義醫科大學附屬醫院 小兒內科,貴州 遵義 563003;2.貴州省兒童醫院 小兒內科,貴州 遵義 563003;3.遵義醫科大學 組織損傷修復與再生醫學省部共建協同創新中心,貴州 遵義 563003;4.貴州茅臺醫院,貴州 仁懷 564500)

地中海貧血(thalassemia)是一種由基因缺陷導致人體珠蛋白(α和/或β-珠蛋白)合成受阻,從而引起貧血或臨床病理狀態的一種遺傳性溶血性貧血疾病,通常分為α地貧和β地貧[1-2]。據統計,全世界每年有70 000名各種類型的地貧兒童出生[3],我國是地貧的高發國家,在南方地區發病率為9.70%～50.15%不等[4]。重型患者需長期輸血及去鐵治療,目前唯一能根治的方法是行造血干細胞移植[5],但是價格較昂貴,且配型及移植后并發癥等問題限制了其廣泛應用,給患者家庭及全社會帶來巨大的經濟和心理負擔[6]。對地貧高危人群進行基因診斷,為育齡期的地貧患者或攜帶者提供適合的生育指導,以及對高風險夫婦的胎兒進行產前診斷及遺傳咨詢以避免重型地貧患兒的出生,是國內外公認的首選預防措施[7-8]。

既往地貧診斷的策略是先在人群中進行血常規及血紅蛋白電泳檢查,隨后對上述兩項出現異常者再進行基因檢查以明確[9]。但血常規及血紅蛋白電泳檢查不能明確基因類型,常規的地貧基因篩查試劑盒僅能檢出有限的地貧基因類型,無法檢測出未知的突變,因此存在一定的漏診及誤診[7, 10]。近年來誕生了第三代測序(third-generation sequencing,TGS)技術,該方法的特點為單分子測序(single molecule sequencing,SMS)和實時測序[11],在特定序列的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)檢測、稀有突變及其頻率測定中具有優勢[1],得到了越來越廣泛的應用。因此,為探討三代測序在地貧診斷中的應用,本研究選取200例可疑地貧者進一步行三代測序明確地貧的基因型、構成比及分布等,為地貧的診斷及治療提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 對象及診斷標準 選取200例疑似地貧且血樣本符合檢測要求的我院門診患者進行研究。查血常規及血紅蛋白電泳進行初篩,依據初篩結果分為初篩陽性組和初篩陰性組,然后進一步行第三代測序檢測。地中海貧血的診斷參考《α-地中海貧血的臨床實踐指南》及《β-地中海貧血的臨床實踐指南》中的標準[12-13]。本研究通過遵義醫科大學附屬醫院生物醫學研究倫理委員會審查(倫理審查批件號：KLL-2023-532)。

1.2 檢測方法 血常規及血紅蛋白電泳檢測均于遵義醫科大學附屬醫院臨床檢驗科完成,以平均紅細胞體積(MCV)<80 fL(正常參考值范圍80～94 fL)和/或平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)<26 pg(正常參考值范圍26～32 pg)和/或血紅蛋白F(Hb F)>2%(正常參考值范圍≤2%)和/或血紅蛋白A2(Hb A2)<2.5%或>3.5%(正常參考值范圍2.5%～3.5%)定為地貧初篩陽性,其中,Hb A2<2.5%視為α地貧初篩陽性,Hb A2>3.5%和/或Hb F>2%視為β地貧初篩陽性。初篩后剩余外周血樣本送貝瑞基因(北京貝瑞和康生物技術有限公司),先進行基因組DNA提取,核酸分析儀檢測DNA濃度和純度合格后進行三代測序,測序平臺為pacific biosciences(PacBio)sequel。

2 結果

2.1 受檢者基本信息及地貧初篩結果 共納入200例研究對象,男性92例,女性108例,年齡19～40(27.07±5.18)歲,漢族35例,少數民族165例,其中侗族76例,苗族44例,布依族21例,壯族11例,水族10例,瑤族3例;依據地中海貧血初篩標準,初篩陽性者120例(其中α地貧初篩陽性51例,β地貧初篩陽性41例,其余28例無法確定初步分型),男性57例,女性63例,其中漢族24例,侗族47例,苗族28例,水族7例,布依族7例,壯族6例,瑤族1例;初篩陰性者80例。初篩陽性組與陰性組性別、年齡及民族分布比較,差異無統計學意義(P>0.05,表1)。

2.2 血常規及血紅蛋白電泳篩查結果 200例疑似地貧患者依據初篩結果分為地貧初篩陽性組和陰性組,其血常規(MCV、MCH)及血紅蛋白電泳(Hb F、Hb A2)結果如下(表2)。

表2 血常規及血紅蛋白電泳結果

2.3 第三代測序結果

2.3.1 地貧初篩陽性組及陰性組中基因陽性情況 地貧初篩陽性組(120例)行第三代測序共檢出地貧基因陽性84例,基因陽性率70.0%(84/120),其中α地中海貧血47例(56.0%,47/84),β地貧34例(40.5%,34/84),α/β復合地中海貧血基因型3例(3.6%,3/84),地貧基因陰性36例(30.0%,36/120)。地貧初篩陰性組(80例)行第三代測序共檢出地貧基因陽性28例,基因陽性率35.0%(28/80),其中α地貧23例(82.1%,23/28),β地貧4例(14.3%,4/28),α/β復合地中海貧血基因型1例(3.6%,1/28),地貧基因陰性52例(65.0%,52/80)。兩組間地貧類型構成的差異有統計學意義(P<0.05),初篩陽性組較陰性組的β地貧占比高,初篩陰性組較陽性組的α地貧占比高(表3)。

表3 地中海貧血基因陽性分布情況

2.3.2 地貧基因陽性組中不同基因型之間、不同基因型與基因陰性組之間常規篩查指標比較 (1)地貧初篩陽性組中按基因結果分為基因陽性組和基因陰性組,基因陽性中再依據不同基因型分類,比較地貧基因陽性組中不同基因型之間、不同基因型與基因陰性組之間血常規及血紅蛋白電泳結果,發現：α地貧中,Hb CS雜合的MCH值、Hb WS雜合的Hb A2值均較--SEA/αα高,差異有統計學意義(P<0.05);--SEA/αα和-α3.7/αα的Hb A2值、CD17的MCH值均較基因陰性組低,-28的MCV、MCH及Hb A2值和CD41-42、CD17的Hb A2值均較基因陰性組高,差異有統計學意義(P<0.05)。其余組間差異無統計學意義(P>0.05,表4)。

(2)地貧初篩陰性組中,比較地貧基因陽性組中不同基因型之間、不同基因型與基因陰性組之間血常規及血紅蛋白電泳結果,發現：α地貧中,-α4.2/αα的MCV值、-α3.7/αα和-α4.2/αα的MCH值均較--SEA/αα低,差異有統計學意義(P<0.05);-α4.2/αα的MCV值、-α3.7/αα和-α4.2/αα的MCH值、-α3.7/αα和Hb CS雜合的Hb A2值均較基因陰性組低,差異有統計學意義(P<0.05)。其余組間差異無統計學意義(P>0.05,表5)。

表5 初篩陰性組中基因陽性與陰性組血常規及血紅蛋白電泳比較

2.3.3 初篩陽性及陰性組中地貧基因型及分布情況 初篩陽性組的84例基因陽性者中,α地貧47例,以--SEA/αα(46.8%,22/47)及-α3.7/αα(25.5%,12/47)突變型為主;初篩陰性組的28例基因陽性患者中,α地貧23例,以--SEA/αα(26.1%,6/23)、-α3.7/αα(21.7%,5/23)及-α4.2/αα(21.7%,5/23)突變型為主(表6)。

表6 兩組中α地中海貧血基因型及分布

初篩陽性組中,β地貧34例,以CD41-42(52.9%,18/34)及CD17(35.3%,12/34)突變型為主;初篩陰性組中,β地貧4例,均為CD41-42(100.0%,4/4,表7)。

表7 兩組中β地中海貧血基因型及分布

初篩陽性組中,α/β復合地中海貧血基因型3例;初篩陰性組中,α/β復合型地貧1例,為Hb CS雜合復合CD41-42型(表8)。

表8 兩組中α/β復合型地中海貧血基因型及分布

2.3.4 地貧基因民族分布 三代測序共檢出地貧基因陽性112例,其中α地貧70例,共11種基因型,主要基因型--SEA/αα和-α3.7/αα在侗族分布最多,其次為苗族和漢族。β地貧38例,共5種基因型,主要基因型CD41-42在侗族分布最多,其次為布依族和漢族;基因型CD17在侗族分布最多,其次為漢族。α/β復合地中海貧血4例,共4種類型,在侗族、苗族、布依族和瑤族中各1例(表9)。

表9 各民族中地中海貧血基因型及分布[例(%)]

2.3.5 第三代測序檢出的地貧基因型種類 經查閱文獻,常規地貧基因檢測試劑盒主要能檢測出以下26種基因類型：--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、Hb CS雜合、Hb WS雜合、Hb QS雜合、IVS-Ⅱ-654(HBB：c.316-197 C>T)、-28(HBB：c.-78A>G)、-29(HBB：c.-79A>G)、-30(T>C)、-31(A>C)、-32(C>A)、CD14-15(HBB：c.45-46 ins G)、CD15-16(+G)、CD17(HBB：c.52A>T)、IVS-I-5(G>C)、CD30(A>G)、IVS-I-I(G>T)、CD26(G>A)、CD27-28(HBB：c.84-85 ins C)、CD41-42(HBB：c.126_129 delTTCT)、CD43(HBB：c.130G>T)、CD37(G>A)、CD71-72(HBB：c.216-217 ins A)、IVS-Ⅱ-5(G>C)、-73(A>T)和-90(C>T)。

本研究中經第三代測序共檢出18種不同地貧基因型,其中有8種(44.4%,8/18)是常規試劑盒無法檢出的類型,分別為αααanti3.7/αα、αααanti4.2/αα、--SEA/-α3.7、Hb Hekinan Ⅱ、HKαα/αα、82|I-0|HBB：c.-100G>A Hete、399|I-1|-22 C>T Hete和2073|Ⅲ|IVS-Ⅱ-806(G>C)Hete;其中4種(22.2%,4/18)為罕見突變類型,如香港型和1例位于內含子處的突變類型。表10所示的4種地中海貧血基因型為本研究中第三代測序檢出的已報道過的罕見地貧基因類型。

表10 第三代測序檢出的罕見突變基因型

3 討論

地中海貧血是一種嚴重威脅人類健康、導致死亡和殘疾的遺傳性血液病[14],目前唯一的治愈方法是異基因造血干/祖細胞(HSPCs)移植,但該方法受到供體及移植后并發癥等多種因素限制[15]。地貧已成為了世界性的重大公共衛生問題[16-17],重型地貧一旦漏診,將會給患者家庭及社會帶來沉重的負擔,因此,為提升全民健康水準,基于該病目前的發病及治療形勢,需要從準確的檢測出發,提高人群檢出率,避免重型患兒的出生。

地中海貧血臨床癥狀的輕重因基因型而異,嚴重者可因胎兒水腫而胎死腹中,重型患者多需終生輸血及袪鐵治療,攜帶者往往沒有典型的臨床癥狀,而血常規和血紅蛋白電泳檢測結果不具特異性,因此,做為地貧初篩的方法不僅無法明確診斷,也可能遺漏部分患者[18-19]。隨著基因測序技術的出現、發展及進步,為人類基因組的表征做出了巨大的貢獻,徹底改變了臨床基因診斷和研究方法[11,20]。第一代測序技術運行時間短,但每個反應只能獲得一個閱讀長度,不適合大規模高通量測序[21],第二代測序技術由于測序儀器、試劑和生物信息學技術人員的高成本一定程度上影響了自身的應用,而近年來備受關注的第三代測序技術,又名單分子實時測序技術,在進行DNA測序時不需經過PCR擴增,故不存在因擴增而引入的堿基錯誤,在特定序列的SNP檢測、稀有突變及其頻率測定中優勢突出[1],且在直接檢測DNA和RNA修飾方面也很有前景[22],得到了越來越多的應用,但是在地貧診斷中研究較少。因此,本研究擬進一步探討第三代測序技術在地貧診斷中的應用,了解地貧基因類型、構成比等,為地貧的診斷提供理論依據。

本研究中,對200例可疑地貧患者進行血常規及血紅蛋白電泳檢測發現地貧初篩陽性120例,陰性80例,在性別、年齡及民族中無差異。應用三代測序技術分別對地貧初篩陽性及陰性組進行檢測,發現初篩陽性組中地貧基因的陽性率為70.0%,而初篩陰性者中基因陽性率為35.0%,證實了血常規及血紅蛋白電泳篩查的確存在較高的漏診率[23],尤其在地貧高發的地區,常規篩查陰性的人群不能完全除外地中海貧血,他們可能仍為攜帶者[24],提示單純的血液學檢測往往會造成漏診,需進一步行三代測序進行確診。同時,我們深入分析了初篩陰性人群中漏診地貧患者的血常規及血紅蛋白電泳結果,發現-α4.2/αα的MCV和MCH值、-α3.7/αα的MCH和Hb A2值以及Hb CS雜合的Hb A2值均較基因陰性組低,提示在利用血常規和血紅蛋白電泳進行地貧初篩時,可能需適當調整MCV、MCH及Hb A2(低值)作為判斷初篩陽性的臨界值來進一步降低漏診,但由于本文中的研究對象及覆蓋地域等有限,暫無法做更深入和全面的探索,將在后續的研究中繼續完善。

接下來我們比較了各組間地貧類型的構成,發現初篩陽性組較陰性組的β地貧占比更高,而陰性組較陽性組的α地貧占比更高,提示在初篩陰性的人群中,α地貧被漏診的機率更大。同時也發現,初篩陽性組中β地貧的檢出率(40.5%)較既往Xu、Tan、 Su等[25-27]報道的比率(26.0%,25.9%和24.0%)更高,考慮是因為β地貧主要由單核苷酸位點變異(single nucleotide variants,SNV)引起[28],既往的基因檢測方法容易漏診,而本研究中使用的第三代測序技術在點突變的檢測上更得心應手,因此提高了β地貧的檢出率,降低了漏診及誤診。分析地貧基因型發現,初篩陽性與初篩陰性組中的主要基因類型較一致,α地貧以--SEA/αα、-α3.7/αα和-α4.2/αα突變型為主,β地貧以CD41-42突變型為主,主要基因類型及α地貧較β地貧多見的情況與既往報道一致[29-30]。

本研究中少數民族人數占82.5%,符合我省是少數民族聚居地的特點。112例地貧基因陽性者中,少數民族占比(83.9%)高于漢族,且基因型種類也較漢族多樣,以侗族及苗族為代表;但這與既往王芳等[31]的研究結果不盡相同,提示同省不同地區少數民族人口分布及地貧基因攜帶存在差異,且可能隨時間變遷而發生變化,因此需針對性地進行宣教和制定不同的預防機制,定期進行監測。此外,在本研究中其余少數民族雖檢出地貧基因陽性,但受檢人數較少,缺乏代表性,故未做詳細分析,待收集到更詳盡的數據再作補充和討論。

血常規及血紅蛋白電泳檢測無法明確地貧基因型,既往常用于地貧初篩,而普通的地貧基因檢測試劑盒檢出的基因類型有限(僅20～30余種)[32],遠遠不能滿足精準診斷的目標。在本研究中,我們利用三代測序明確了112例地貧基因陽性者,共檢出地貧基因型18種,其中8種(44.4%)用常規地貧基因試劑盒無法檢出,包括了4種(22.2%)罕見的地貧基因型[33-36]。同時也發現,隨著測序技術在地貧診斷中的不斷深入,α珠蛋白三倍體的檢出率較前升高,單純的α珠蛋白三倍體常無特異性表現,但當它與β地貧共同遺傳時,下一代則可能出現中間型地貧的臨床癥狀[2],這對遺傳咨詢及產前診斷顯得尤為重要。可見,第三代測序不僅可以明確地貧基因型,其檢測廣度更優于普通地貧基因試劑盒,檢出類型較多,對罕見變異體的識別也是一種有前途的檢測方法[37],能提高罕見基因型的檢出率,甚至發現未知基因類型[38],精確診斷也為遺傳咨詢及患者診治提供更好的參考,避免漏診及誤診,對地貧高發且人口基數大的國家意義尤為重大,同時也能豐富人類地貧基因庫。第三代測序技術的應用能提高地貧的檢出率,結合遺傳咨詢已減少了部分重型地貧患兒的出生,正努力實現重型地貧零出生的目標,進一步提高人口素質,減輕患者家庭和社會的經濟負擔。

綜上所述,第三代測序技術能明確地貧基因型及檢出罕見基因突變,較常規地貧基因檢測試劑盒覆蓋更多的基因類型,能提高地貧檢出率、降低漏診率。而血常規及血紅蛋白電泳雖能篩出高度疑似地貧的人群,但存在較高的漏診率,因此,先采用常規檢測方法在人群中進行地貧初篩,再對初篩陽性者行基因測序確診的這種傳統地貧篩查方式存在弊端,建議直接行第三代測序確診以避免遺漏,尤其對于高發地區的人群。