人參總皂苷對博萊霉素誘導肺纖維化小鼠IL-6及IL-1β的影響

肖 紅,羅 婷,凌 虹,楊會云,鄧 江,2

(1.遵義醫科大學 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室,貴州省基礎藥理重點實驗室,藥學院藥理學教研室,貴州 遵義 563006;2.中國藥理學會—貴州省藥理學聯合實驗室,貴州 遵義 563006)

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是一種慢性、進行性、不可逆肺部疾病的病理表現,經診斷后中位生存期為2～5年,嚴重威脅人類生命健康[1]。多種致病因素如環境污染、病毒感染或抗腫瘤藥等可引起肺泡上皮細胞持續損傷,細胞凋亡,免疫細胞大量浸潤,激活白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎癥因子異常表達,誘發肺組織炎癥反應,進而促進病理性纖維化的發生發展[2-3]。人參總皂苷為五加科植物人參的主要有效活性成分,具抗氧化、抗炎等作用,可抑制細胞凋亡,減少炎癥反應[4],而炎癥反應在肺纖維化主要病理過程中發揮重要作用[5]。為探索人參總皂苷是否通過調控炎癥因子IL-6及IL-1β而抑制肺纖維化的病程進展,本研究擬建立博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型,探討人參總皂苷對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠肺組織中促炎細胞因子IL-6及IL-1β的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥品與儀器 人參總皂苷(total ginsenosides,TG),北京恒康益百科技有限公司生產,批號：20210601,純度80%;注射用鹽酸博萊霉素(bleomycin hydrochloride for injection,BLM),翰暉制藥有限公司生產,批號：21150111;吡菲尼酮(pirfenidone,PFD),北京康蒂尼藥業股份有限公司生產,批號：國藥準字H20133376。Ⅰ型膠原蛋白(type-I collagen,COL Ⅰ),HUABIO,貨號：ET1609-68;IL-1β(interleukin-1β,IL-1β),MCE,貨號：HY-FS-230818011;IL-6(interleukin-6,IL-6),proteintech,貨號：21865-1-AP以及β-actin,proteintech,貨號：66009-1-IG;Olympus正置顯微鏡,日本Olympus公司,型號：BX43+DP2b;Chemi Doc化學發光凝膠成像系統,美國BIO-RAD公司,型號：Chemi Doc。

1.2 實驗動物及分組給藥 購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證編號：SCXK(湘)2019-0004)的60只SPF級雄性昆明小鼠,平均體重28～30 g,周齡6～7周,分籠于SPF級動物房,使用輻照滅菌實驗鼠糧飼養,進食、飲水自由。小鼠適應環境1周后,隨機分為6組,即正常組(Control),模型組(BLM,氣管內滴注BLM 3 mg/kg),人參總皂苷40、80、160 mg/kg給藥組(BLM+TG40,BLM+TG80,BLM+TG160),吡菲尼酮陽性藥組(PFD),各組氣管內滴注液體容量為0.02 mL/10 g,每組10只。在造模次日灌胃給藥(i.g),正常組與模型對照組均以同體積蒸餾水灌胃,連續給藥14 d。

1.3 肺纖維化小鼠模型制備 將小鼠以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行腹腔注射麻醉后取俯臥位,固定小鼠上門齒打開口腔,以小鼠壓舌板壓住舌根處,將博萊霉素(3 mg/kg)沿口腔上顎中線經主支氣管滴注入肺,滴注后立即使小鼠身體豎立并沿縱軸旋轉,以使藥液均勻分布于雙肺中,觀察并監測生命體征。待小鼠清醒后送SPF級觀察室常規飼養。所有實驗操作與飼養過程均遵守實驗動物管理與動物倫理保護相關準則,倫理號：倫審(2018)2-120。

1.4 小鼠肺組織病理形態學觀察 取材觀察小鼠肺組織大體形態的變化,隨后取小鼠左肺組織以10%甲醛溶液(PBS∶甲醛=9∶1)常溫固定48 h,經梯度酒精脫水、石蠟包埋切片備用,分別進行HE以及Masson染色。根據Szapiel及Ashcroft評分標準表(表1、2),評估肺泡結構的完整性、炎癥細胞浸潤以及纖維化的嚴重程度[6-7]。

表1 Szapiel評分標準

表2 Ashcroft評分標準

1.5 小鼠肺組織中COLⅠ以及炎癥因子IL-6及IL-1β蛋白水平測定 使用標準SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行蛋白質印跡[8],從肺組織中提取總蛋白在10%SDS-PAGE凝膠上分離后,并通過電泳盒半干轉到PVDF膜上,然后與以下一抗：Collagen Ⅰ(HUABIO,貨號ET1609-68,稀釋度1∶2 000);IL-1β(MCE,貨號HY-FS-2308180118,稀釋度1∶1 000);IL-6(proteintech,貨號21865-1-AP,稀釋度1∶1 000)于4度搖床孵育過夜(20 h),并與蛋白質免疫印跡IgG底物結合。通過Chemi Doc-Touch化學發光成像系統顯影并保存,使用Image J軟件分析條帶的灰度值。

2 結果

2.1 人參總皂苷對肺纖維化小鼠一般情況及肺組織病理形態的影響 口腔內氣管單次滴注博萊霉素1周左右,小鼠開始出現活動減少,食欲不振毛發干枯,呼吸短促等癥狀。給予博萊霉素14 d后取材顯示,正常組小鼠肺大體組織顏色紅潤,模型組小鼠肺大體組織顏色灰暗,可見明顯淤血、水腫,TG可顯著改善小鼠的一般狀態及肺組織大體形態學的變化(圖1)。

A：Control組;B：BLM組;C：BLM+TG40組;D：BLM+TG80組;E：BLM+TG160組;F：BLM+PFD組。

HE染色結果顯示,正常組小鼠肺組織結構連續完整,無明顯肺泡炎癥細胞浸潤和肺組織纖維化。給予博萊霉素14 d后,小鼠肺組織肺泡間隔增厚,肺泡間出現明顯水腫,肺組織塌陷,炎癥細胞浸潤,形成大量纖維組織團塊;提示在氣管內單次滴注博萊霉素導致了小鼠肺組織的炎癥損傷加快肺纖維化進程。并且在給予TG后可顯著改善博萊霉素所致的病理組織塌陷,減輕肺水腫(圖2)。

A：Control組;B：BLM組;C：BLM+TG40組;D：BLM+TG80組;E：BLM+TG160組;F：BLM+PFD組,HE,Bar=50 μm,n=6。

在HE染色的基礎上根據Ashcroft評分標準以及Szapiel評分標準得出,博萊霉素使小鼠肺組織中Ashcroft評分、Szapiel評分顯著增高(P<0.05);且TG顯著降低了Ashcroft評分、Szapiel評分(P<0.05),進一步說明了TG可改善博萊霉素所誘導的小鼠肺纖維化(圖3)。

組與對照組比較, P<0.05;#：TG組與BLM組比較, P<0.05。

Masson染色結果顯示,正常組小鼠肺組織正常,有少量藍色膠原纖維沉積。給予博萊霉素14 d后,小鼠肺組織中出現大面積藍色膠原纖維在細胞外基質中沉積,表明博萊霉素導致了小鼠肺組織損傷以及進一步肺纖維化。同時給予TG可顯著抑制膠原纖維在小鼠肺組織中大量沉積(圖4)。

A：Control組;B：BLM組;C：BLM+TG40組;D：BLM+TG80組;E：BLM+TG160組;F：BLM+PFD組;Masson,Bar=50 μm,n=6。

在Masson染色基礎上,進一步分析膠原纖維在小鼠肺組織整體中的占比(即膠原容積分數%)得出,博萊霉素可使小鼠肺組織中膠原容積分數顯著增高(P<0.05),給予TG后可降低膠原容積分數(P<0.05,圖5)。

組與對照組比較, P<0.05;#：TG組與BLM組比較, P<0.05。

2.2 人參總皂苷對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠肺組織中COL Ⅰ蛋白表達水平的影響 為了研究COL Ⅰ在博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠體內肺組織中以及在人參總皂苷給藥后小鼠肺組織中的變化情況,采用Western blot法檢測COL Ⅰ蛋白表達水平的變化,數據分析結果表明,博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠肺組織中COL Ⅰ蛋白水平明顯增加(P<0.05),人參總皂苷給藥14 d后肺纖維化小鼠肺組織中COL Ⅰ顯著降低(P<0.05,圖6)。

組與對照組比較,P<0.05;#：TG組與BLM組比較, P<0.05。

2.3 人參總皂苷對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠肺組織中促炎細胞因子IL-6及IL-1β的影響 組織炎癥反應的發生與IL-6及IL-1β密切相關,從昆明小鼠肺纖維化肺組織大體形態學變化、HE以及Masson染色等病理組織學結果以及Western blot結果顯示TG80 mg/kg改善PF的效果顯著。故后續研究選擇TG80 mg/kg劑量組進一步研究,肺纖維化發展過程中IL-6及IL-1β的變化,在BLM誘導的PF小鼠肺組織中BLM組的炎性介質IL-6及IL-1β蛋白表達水平明顯上調(P<0.05),給予TG80 mg/kg后IL-6及IL-1β蛋白表達水平顯著下調(P<0.05,圖7)。這些研究數據表明,TG80 mg/kg可能通過調節炎性介質IL-6及IL-1β來改善BLM誘導的小鼠PF。

組與對照組比較, P<0.05;#：TG組與BLM組比較, P<0.05。

3 討論

促炎細胞因子白細胞介素6(IL-6)和白介素1β(IL-1β)與肺纖維化的發生與發展密切相關,可以促進炎癥反應,誘導肌成纖維細胞活性增加而引起肺纖維化[9-11]。IL-6可由多個器官系統內的免疫和非免疫細胞產生,并反作用于這些細胞,并且它的過度合成可導致急性全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)[12-13]。在各種潛在免疫疾病(自身免疫性疾病和炎癥性疾病)中,IL-6蛋白表達水平顯著升高,加速疾病的進程[12,14]。IL-1β被認為是急性炎癥反應的引發劑,參與肺纖維化的發展并引發相關的炎癥反應[15]。此外,IL-1β可增強IL-6和TNF-α的表達,破壞肺泡結構,導致膠原沉積和肺成纖維細胞增加[19-20]。博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型是最常用的、最經典的模型之一,并且它可在小鼠體內誘發肺組織急性炎癥,3～5 d后達到峰值,隨后成纖維細胞增殖、膠原沉積和肺纖維化[16-18]。值得注意的是,在本研究結果中,博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠體內IL-6和IL-1β蛋白水平明顯上調,出現大量炎癥反應及纖維化反應。膠原蛋白纖維化標志物之一,在肺纖維化中起著關鍵作用[21]。膠原蛋白(如COL Ⅰ)的異常沉積可導致細胞外基質異常沉積,損害小鼠肺功能,加重肺纖維化發展進程[22]。為了驗證博萊霉素是否可以通過誘導COL Ⅰ的表達而導致肺纖維化的形成,本研究以6～7周齡SPF級雄性昆明小鼠為研究對象,經口腔內氣管單次滴注博萊霉素(3 mg/kg)14 d后,在HE染色以及Masson染色的組織病理形態結果顯示,大量炎癥細胞浸潤,肺部炎癥反應嚴重,并表現出肺纖維化典型的組織學變化：肺組織水腫,肺泡間隔增厚,肺泡壁塌陷,肺組織結構嚴重破壞等;肺纖維化小鼠組織學顯著改變導致肺組織纖維化評分、肺泡炎評分以及膠原容積分數增加。在本實驗結果中,博萊霉素誘導肺纖維化小鼠肺組織中藍色膠原纖維沉積顯著增多以及COL Ⅰ蛋白水平明顯增多,并且肺組織結構損傷,導致肺功能障礙,使肺纖維化小鼠出現明顯的呼吸急促以及呼吸困難導致小鼠食欲不振及活動量減少等情況。驗證了博萊霉素可以通過誘導COL Ⅰ的表達而形成肺纖維化。人參總皂苷是中國傳統中藥五加科植物人參的主要有效成分,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等活性[23]。在本研究發現,在博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠中給予人參總皂苷不僅可以改善了肺纖維化小鼠呼吸困難、蜷縮、發抖,毛色灰暗干枯、以及進食飲水減少和活動量減少等情況。而且從小鼠肺組織病理切片顯示給予人參總皂苷14 d后減輕了膠原纖維沉積以及肺組織結構損傷,蛋白印跡結果也發現IL-6、IL-1β以及COL Ⅰ的蛋白表達水平降低。因此,人參總皂苷可通過降低COL Ⅰ的蛋白表達水平,下調促炎癥因子IL-1β和IL-6而改善博萊霉素誘導的肺纖維化進程,但其調控機制有待進一步深入研究。