新型氮氧自由基HPN對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺氧相關蛋白表達的影響

梁 恒,錢 軍,劉志鵬,羅紅波

(遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院 神經內科,廣東 珠海 519100)

腦卒中是神經系統常見疾病之一。腦卒中分為缺血性卒中和出血性卒中,針對急性缺血性腦卒中,及時采用藥物或介入手段使腦血流量恢復是早期治療腦缺血最有效的臨床手段,但隨著血流的再通,會引起缺血區的腦組織細胞二次受損,稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury, CI-RI)[1-2]。缺血再灌注損傷的機制眾多,如鈣離子超載、氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應、血腦屏障破壞、線粒體功能障礙等[3]。線粒體是活性氧自由基(ROS)產生的主要場所,當線粒體功能障礙時,大量ROS產生會導致細胞功能障礙或凋亡。缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)作為一種核轉錄因子,廣泛表達于全身各組織,其中缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)與腦血管疾病密切相關,HIF-1α的表達受到多因素的調控,如氧濃度、ROS等,是腦卒中后調節氧穩態的重要介質[4]。正常氧濃度條件下,HIF-1α表達受到抑制,半衰期短,在缺氧狀態下,HIF-1α的表達增強。ROS對HIF-1α的調控較為復雜且不穩定,可能與腦缺血缺氧的程度、ROS的水平、內源性抗氧化酶的活性等有關[5]。

在缺血缺氧情況下,一方面,HIF-1α通過激活下游的靶點基因,如血管內皮生長因子(VEGF)等,使之表達相關蛋白產物,增加組織對缺氧的耐受性,發揮抗缺氧作用[6-7]。VEGF可促進血管內皮再生、抑制內膜增厚,減輕腦缺血灌注損傷,外源性VEGF也可誘導腦組織血管生成,加快神經功能恢復[8]。另一方面, HIF-1α 通過誘導促凋亡因子,如 Nix,BNip3和 IL-20導致線粒體功能障礙導致細胞死亡,故HIF-1α的作用是雙相模式,新型氮氧自由基4-羥基2-取代苯基硝基氮氧化物(4’-hydroxyl 2-substituted phenylnitronyl nitroxide, HPN)是一種新型的抗氧化劑和自由基清除劑(圖1),與普通的氮氧自由基相比,HPN更容易跨過血腦屏障,有效清除缺氧誘導的活性氧自由基(ROS),更好的發揮神經保護作用[9-11]。在本實驗中,我們構建腦缺血再灌注損傷的大鼠模型(MCAO/R),采用分子細胞生物學及病理學等方法,探究HPN對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺氧相關蛋白HIF-1α、VEGF表達的影響。

圖1 HPN化學結構式

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 本實驗主要試劑包括2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC,貨號：T8170);蘇木素(HE,貨號：H9627,Sigma公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：PC0020,Solarbio公司);PAGE凝膠快速制備試劑盒(貨號：PG112,中國雅酶公司);HIF-1α抗體(貨號：340462,成都正能生物公司);VEGF抗體(貨號：R26073,成都正能生物公司);β-actin(貨號：380624,成都正能生物公司);Trizol(qpcr,貨號：15596-026,Ambion公司)。

1.1.2 實驗動物 所有實驗動物均購買于珠海百試通生物科技有限公司,許可證號：SCXK(粵)2020-0051,健康成年的SPF級雄性SD大鼠,體重240～300 g。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 根據前期實驗研究[9],在高原缺氧小鼠模型中,神經保護最佳的給藥濃度為100 mg/kg,故本實驗選取100 mg/kg為基礎給藥濃度。將60只SD大鼠采用隨機數表法分為假手術組、模型組、HPN低、中、高劑量組(100、150、200 mg/kg),每組12只,模型組于造模前20～30 min經腹腔注射0.9%等滲生理鹽水,HPN低、中、高劑量組分別于造模前20～30 min經腹腔注射HPN(低：100 mg/kg;中：150 mg/kg;高：200 mg/kg)。假手術組僅分離右側頸內動脈,其余各組采用改良的 Longa 線栓法構建右側大腦中動脈阻塞再灌注模型[12]。本研究獲得遵義醫科大學(珠海校區)倫理委員會審批,審查編號為[2023]2023ZH0039。

1.2.2 Longa線栓法構建MCAO/R模型 使用1%的戊巴比妥腹腔注射麻醉動物,在手術過程中,首先暴露右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈并進行分離,然后結扎頸總和頸外動脈,在頸總動脈結扎線遠心端開一小口,插入線栓阻塞動脈,并將線栓固定,最后縫合皮膚。在假手術組中,僅僅進行頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈的暴露與分離,然后縫合皮膚。將造模后的小鼠置于37 ℃加熱墊上保溫復蘇。線栓阻塞動脈2 h后,拔出線栓,讓缺血側腦組織血流灌注24 h。造模2 h后采用Zea-Longa法評分篩選2～3分大鼠入組,各組大鼠于斷頭取腦前進行mNSS評分進行神經功能缺損評分,對于失敗模型,應排除,并按照隨機原則補充大鼠,并重新制作MCAO/R模型,術后動物置于干凈通風的鼠籠單籠飼養,自由進食。Zea-Longa評分法為0分：無神經損害癥狀;1分：左側前爪不能完全伸展;2分： 向左側轉圈;3分：行走時向左側傾倒;4分：不能自發行走及意識障礙; 選取2～3分大鼠入組進行后續實驗[13]。

1.2.3 神經功能評分(mNSS評分) 缺血再灌注24 h后嚴格按照評分標準[14],從運動、感覺、平衡和反射4個方面進行評分。評分標準見表1。

表1 mNSS評分標準

1.2.4 TTC染色測定腦梗死體積 缺血再灌注24 h后,迅速取腦,放入-20 ℃冷凍20～30 min后,沿腦冠狀面,人字縫處開始向前連續切5片,每片厚約2 mm,放入現配的1% TTC溶液中浸泡,37 ℃保溫箱中避光孵育20 min后將腦組織翻面再次避光孵育20 min,用固定液(4%多聚甲醛)固定過夜后置于藍色背景下拍照。采用Image-J軟件對梗死體積進行分析。梗死體積百分比[15]=(對側半球體積-梗死側正常體積)/對側半球體積×100%。

1.2.5 HE染色 缺血再灌注24 h后,迅速斷頭取腦,將其放置于多聚甲醛溶液(濃度4%)中浸泡固定48 h,然后脫水、石蠟包埋、切成厚度約為5 μm薄片,經過HE染色,再用樹脂進行封片。接著利用顯微鏡觀察腦組織病理學變化,最后進行拍照后分析。

1.2.6 實時定量PCR檢測HIF-1α、VEGF基因表達 使用Trizol試劑提取總RNA,使用超微量紫外可見分光光度計測得OD260/OD280比值,比值為1.8～2.0時滿足實驗要求,采用兩步法將RNA逆轉錄為cDNA,使用SYBR Green進行實時PCR,本實驗所用引物見表2。

表2 qPCR基因的引物序列

1.2.7 Western blot檢測HIF-1α、VEGF蛋白表達 稱取適量腦組織在RIPA緩沖液(含有PMSF和磷酸酶抑制劑)中置于冰上研磨直至無明顯塊狀組織,離心后(12 000 r/min, 20 min)取上清液,通過BCA蛋白檢測試劑盒測定總蛋白濃度。用10% SDS-PAGE凝膠分離不同分子量的蛋白質,再轉膜到PVDF膜上,用含無蛋白快速封閉液浸泡PVDF膜,在搖床上封閉15～30 min,加入一抗在4 ℃孵育過夜(HIF-1α,1∶1 000;VEGF,1∶200;β-actin,1∶20 000)。第2天用TBST洗去一抗后浸泡在二抗孵育液中(1∶10 000),避光孵育2 h,再將二抗洗去后用ECL顯色劑增強化學發光進行觀察。

2 結果

2.1 不同劑量HPN對神經功能缺損的影響 根據mNSS評分標準對缺血再灌注24 h進行神經功能缺損評分,分數越高,神經功能缺損越嚴重。實驗結果如圖2所示,假手術組無明顯神經功能缺損,與假手術相比,模型組有明顯神經功能缺損癥狀(P<0.01),與模型組相比,HPN給藥組神經功能缺損均有改善(P<0.05),隨HPN給藥劑量的增加,神經功能缺損癥狀改善越明顯,與HPN低劑量給藥組相比,HPN中、高劑量給藥組有明顯改善(P<0.05),其中HPN高劑量組療效最明顯。

A：與假手術組比較,P<0.01;b、c：與模型組比較,P<0.05、P<0.01;d、e：與HPN低劑量組比較,

2.2 不同劑量HPN對腦梗死面積的影響 采用TTC染色測定腦梗死面積,如圖3所示,與假手術組相比,模型組檢測大面積的白色腦梗死區域(P<0.01)。與模型組相比,HPN給藥組腦梗死面積均有明顯改善(P<0.01)。與HPN低劑量給藥組相比,HPN中、高劑量給藥組有明顯改善(P<0.01),隨HPN給藥劑量的增加,腦梗死面積改善越明顯,以HPN高劑量組改善效果最明顯。

A：TTC染色;B：腦梗死面積統計分析;a：與假手術組比較,P<0.01;b：與模型組比較,P<0.01;c：與HPN低劑量組比較,

2.3 不同劑量 HPN對梗死側皮層組織形態的影響 如圖4所示,在假手術組中,皮層細胞數量豐富,排列有序,細胞輪廓清晰,沒有核固縮或壞死現象。相比之下,MCAO/R模型組中細胞核固縮形成明顯的空洞狀,具有明顯壞死現象,細胞數量減少,并且排列紊亂。與MCAO/R模型組相比,各劑量組中的細胞狀態得到改善,細胞死亡減少,其中以HPN高劑量給藥組中表現出最明顯的改善效果。

A：假手術組;B：模型組;C：HPN低劑量組;D：HPN中劑量組;E：HPN高劑量組;標尺為50 μm,放大倍數×200。

2.4 不同劑量HPN對缺氧相關蛋白HIF-1α、VEGF基因表達的影響 結果如圖5所示,與假手術組相比,MCAO/R模型組中HIF-1α和VEGF基因表達明顯增加(P<0.01)。與MCAO/R模型組相比,HPN各給藥組中HIF-1α和VEGF基因表達明顯降低(P<0.05,P<0.01)。與HPN低劑量給藥組相比,HPN中、高劑量給藥組HIF-1α和VEGF基因表達降低(P<0.01),以HPN高劑量組降低最顯著。

A：HIF-1α基因表達情況;B：VEGF基因表達情況;a：與假手術組比較,P<0.01;b：與模型組比較,P<0.05;c：與模型組比較,P<0.01;d：與HPN低劑量組比較,

2.5 不同劑量HPN對缺氧相關蛋白HIF-1α、VEGF蛋白表達的影響 結果如圖6所示,假手術組與MCAO/R模型組相比,HIF-1α和VEGF表達在模型組中明顯增加(P<0.01)。MCAO/R模型組與HPN給藥組相比,HIF-1α和VEGF表達在HPN給藥組中明顯下降(P<0.05,P<0.01)。與HPN低劑量給藥組相比,HIF-1α和VEGF表達在HPN中、高劑量給藥組中有明顯下降(P<0.05,P<0.01),以HPN高劑量組降低最顯著。

A、B：Western blot檢測蛋白表達;C、D：蛋白相對表達量;a：與假手術組比較,P<0.01;b：與模型組比較,P<0.05;c：與模型組比較,P<0.01;d：與HPN低劑量組比較,P<0.05;e：與HPN低劑量組比較,

3 討論

急性缺血性腦卒中是一種嚴重的神經科疾病,具有高發病率、高致殘率和高死亡率的特點,是中老年人致死、致殘的主要病因,及時使腦血流量恢復,拯救缺血半暗帶是治療急性缺血性腦卒中的首要原則,但隨著血流的再通,會引起腦缺血再灌注損傷(CI-RI)[1-2]。目前尚無明確治療CI-RI的藥物。HPN是課題組前期合成的一種新型的抗氧化劑和自由基清除劑,能有效清除缺氧誘導的活性氧自由基(ROS),從而發揮神經保護作用[9-11],但HPN在腦缺血再灌注損傷中的機制及作用靶點尚未完全清楚。

缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是一種核轉錄因子,在神經疾病中扮演十分重要的角色,大量研究發現HIF-1α與缺血再灌注損傷密切相關[16-17]。在缺血再灌注損傷后,機體自身也啟動一系列抗損傷機制,該過程與HIF-1α的表達上調密切相關,HIF-1α通過增加下游基因表達相應蛋白,如血管內皮生長因子(VEGF),促紅細胞生成素(EPO)等,參與血管生成、紅細胞生成增加,糖酵解、葡萄糖轉運等生物過程促進細胞存活。研究發現,通過低氧預處理或提前使HIF-1α積累,對腦缺血缺氧均表現出明顯的保護作用[18-19]。血管內皮生長因子(VEGF)是一種可以促進血管內皮細胞生長因子,可促進血管通透性增加、血管內皮細胞遷移、增殖和新生血管形成等作用[20]。腦缺血缺氧后的VEGF的表達調控是多因素的,其中以缺血缺氧為主要的調節因素,缺血缺氧后,HIF-1α通過結合到VEGF基因的啟動子區域上相關靶點結合,促進VEGF基因的轉錄和表達,從而促進血管生成和組織修復[21]。在本實驗中,HIF-1α和VEGF的基因及蛋白表達在MCAO/R模型鼠腦中表達增加,如前所述,模型組中HIF-1α和VEGF的表達增加是機體自身的防御反應,增加機體對缺血缺氧的耐受,減輕腦缺血再灌注損傷。

本實驗針對新型氮氧自由基HPN對缺血再灌注損傷后HIF-1α和VEGF表達的影響進行研究,結果表明,給予HPN處理后,腦皮層組織中HIF-1α和VEGF的表達減少,且隨著HPN劑量的增加,HIF-1α和VEGF表達逐漸減少。此外,HPN處理后的模型大鼠腦梗死面積范圍減少,腦皮層細胞死亡減少、組織間質水腫得到改善,減輕了腦缺血再灌注后的組織損傷。目前的一些研究發現,HIF-1α也參與細胞凋亡的發生,Helton等[22]發現HIF-1α在缺氧缺氧中的主要作用是促進細胞凋亡。Miao等[23]發現,缺氧誘導因子的抑制劑可抑制炎癥反應保護缺血再灌注誘導的組織損傷。HIF-1α的表達受到多因素的調控,除了氧濃度為主要調節因素外,活性氧自由基(ROS)也參與HIF-1α的穩定性調節,但ROS對HIF-1α的調節是促進還是抑制均有報道,Guzy等[24]發現,ROS通過抑制HIF-1α的降解,在缺血缺氧條件下促進HIF-1α和下游靶基因的表達,但Guo等[25]發現,ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸可誘導HIF-1α的表達。He等[26]發現,HIF-1α的作用是相互的,在早期表達促進細胞凋亡,晚期表達促進細胞存活。VEGF使得血管通透性增加的同時,會引起血腦屏障破壞,與腦水腫形成密切相關[27]。因此結合相關研究及實驗結果,HPN調控腦皮層組織中HIF-1α和VEGF的表達減少,可能與氧化應激減輕、炎癥反應的抑制、細胞凋亡的減少等途徑有關。

綜上所述,本研究探討了新型氮氧自由基HPN對腦缺血再灌注損傷后HIF-1α和VEGF表達的影響,初步證實了HPN降低了腦缺血再灌注損傷后HIF-1α和VEGF的表達,并改善了大鼠腦缺血再灌注損傷。