淫羊藿苷通過上調SLC7A11/GPX4軸減輕鐵死亡改善心力衰竭

唐文靜 ,羅亞丹 ,朱盡染 ,文 丹 ,楊丹莉

(1.遵義醫科大學 貴州省基礎藥理重點實驗室,基礎藥理教育部重點實驗室、特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室,貴州 遵義 563006;2.遵義醫科大學 藥學院,貴州 遵義 563006)

心力衰竭(heart failure,HF)是由各種心臟疾病導致的心臟結構與功能紊亂的綜合征,是眾多心血管疾病的終末期,給家庭及社會造成了嚴重的負擔[1]。雖然β受體拮抗藥、ACEI類藥、AT1拮抗藥、醛固酮拮抗藥、利尿藥等在HF臨床防治中得到廣泛應用,但HF的死亡率仍然很高[2]。因此,尋找新的防治HF藥物是亟待解決的問題。鐵死亡是一種鐵依賴程序性細胞死亡方式,其中SLC7A11/GPX4軸下調介導的脂質過氧化物過度積累是鐵死亡發生的關鍵調控因素[3]。鐵死亡通過促進心肌細胞肥大、炎癥及心肌纖維化等心室重構的發生,進而促進HF的發生、發展[4-5]。因此,上調SLC7A11/GPX4軸,減少脂質過氧化物生成,抑制心肌細胞發生鐵死亡,是治療HF的重要策略。

淫羊藿苷( icariin,ICA)是傳統中藥淫羊藿的主要活性成分之一,具有降低血壓、抗心律失常、抗氧化應激、抗炎等多種藥理作用,對心肌缺血性疾病、高血壓心臟病、心律失常等具有潛在治療效應[6]。異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)是一種非選擇性兒茶酚胺β-腎上腺素能受體激動劑,是公認的制備心室病理性重構和心功能障礙動物模型的工具藥[7]。值得注意的是,ICA 干預 ISO 誘導的小鼠心力衰竭是否通過抑制鐵死亡而發揮保護作用尚不清楚。因此,本項目以C57BL/6小鼠為研究對象,用ISO制備心力衰竭動物模型,基于SLC7A11/GPX4軸、脂質過氧化及鐵死亡研究ICA抗ISO所致小鼠心力衰竭的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 7周齡C57BL/6小鼠、SPF級,購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,該公司的許可證號：SCXK(湘)2019-0004,并飼養于SPF級動物房(遵義醫科大學),自由飲食。

1.1.2 藥物與試劑 淫羊藿苷(編號：FY1742-B;南通飛宇生物科技有限公司);異丙腎上腺素(編號：HY-B0468;MCE公司);普魯士藍染色試劑盒(編號：GL428;SolarBio公司);GAPDH兔多克隆抗體(編號：10494-1-AP;Proteintech公司);GPX4鼠多克隆抗體(編號：67763-1-Ig;Proteintech 公司);SLC7A11兔多克隆抗體(編號：26864-1-AP;Proteintech公司);DMT1兔多克隆抗體(編號：AF302536;艾方生物公司);ACSL4兔多克隆抗體(編號：22401-1-AP; Proteintech公司);TFR1兔單克隆抗體(編號：R08-9V6;ZENBIO公司);LPCAT3鼠單克隆抗體(編號：67882-1-lg;Proteintech公司);4-HNE兔多克隆抗體(編號：BC07253787;北京博奧森生物科技有限公司);HRP標記山羊抗兔IgG(編號：SA+00001-2;Proteintech公司);HRP標記山羊抗鼠IgG(編號：SA00001-1;Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模給藥 小鼠適應性喂養1周后,隨機分為5個組：①空白組(Control)：灌胃雙蒸水;②ISO模型組(ISO)：經頸背部皮下注射ISO(15 mg/kg)制備心力衰竭動物模型,并灌胃雙蒸水,連續7 d;③淫羊藿苷低劑量組(ICA-L)和高劑量組(ICA-H)：制備動物模型同②,并且分別灌胃給予ICA(15、60 mg/kg,qd),連續7 d;④陽性藥氯沙坦組(Los)：制備動物模型同②,并且灌胃給予Los(9 mg/kg)。以上各組動物每組均為12只。符合動物福利倫理要求(倫理編號：ZMU22-2203-580)。

1.2.2 左心功能檢測 最后1次給藥結束后,將小鼠麻醉后脫去其左胸部皮毛,并將其固定在檢測臺,涂抹適量耦合劑,采用小動物超聲檢測儀進行檢測并獲取超聲心動圖,分析左心室射血分數(EF%)與短軸縮短率(FS%)的變化。

1.2.3 樣本收集 給藥結束后稱取小鼠重量,腹腔注射濃度為2%的戊巴比妥鈉并以劑量為4.0 mg/kg麻醉小鼠后處死,取出小鼠心臟,剝離右心室,分別進行稱重,并取小鼠左心室部分組織置于中性甲醛中固定,用于病理檢查以及普魯士藍染色,其余心臟組織置于EP管中,并于-80 ℃條件下保存備用。

1.2.4 小鼠心臟質量指數 稱取小鼠體重(g)、心臟及左心室+室間隔的質量(mg),計算小鼠心臟質量指數(HMI)和左心質量指數(LVMI)。

1.2.5 小鼠心臟病理檢測 利用中性甲醛(10%)固定、流水沖洗、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片等操作后,采用不同染色方法,觀察小鼠左心組織病理變化以及鐵離子沉積情況。

1.2.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測蛋白表達 取小鼠左心室組織30～50 mg,1 mg組織加入10 μL組織裂解液(PMSF：RIRA裂解液∶蛋白磷酸酶抑制劑=1∶100∶1),并利用組織勻漿機裂解組織,在冰上靜置30 min,最終在4 ℃、1.2 ×104r/min條件下離心15 min收集上清;采用BCA定量檢測并計算樣本濃度,蛋白上樣量為30 μg/10 μL;電泳分離蛋白,并利用半干轉法進行轉膜,7%牛奶進行封閉2～3 h,一抗GAPDH(1∶5 000)、GPX4(1∶2 000)、SLC7A11(1∶1 000)、ACSL4(1∶5 000)、LPCAT3(1∶2 000)、4-HNE(1∶1 000)、TFR1(1∶1 000)、DMT1(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)4 ℃孵育1 h,ECL顯色。

2 結果

2.1 檢測小鼠左心功能的變化 超聲結果顯示,與空白組相比,ISO模型組的左心室射血分數(EF%)和短軸縮短率(FS%)顯著降低(P<0.05)。與ISO模型組相比,ICA低、高劑量干預組以及Los組的EF%、FS%均顯著升高(P<0.05)。結果見圖1。

A：超聲代表圖依次為Control組、LSO組、ICA-L組、ICA-H組、LOS組;B：射血分數(%);C：短軸縮短率(%); *：與空白組比較, P <0.05; #：與 ISO 組比較,

2.2 小鼠心臟質量指數及左心質量指數的變化 與空白組相比,ISO模型組的HMI、LVMI均顯著升高(P<0.05);與ISO模型組相比,ICA低、高劑量組及 Los組的HMI、LVMI均顯著降低(P<0.05)。結果見圖2。

A：左心室質量指數;B：心臟指數; *：與空白組比較, P <0.05; #：與 ISO組比較,

2.3 病理檢測 HE染色結果顯示,空白組心肌細胞具有正常的組織結構,心肌細胞排列整齊,無炎癥細胞浸潤;與空白組相比,ISO模型組心肌細胞排列紊亂,炎性細胞浸潤明顯;與ISO模型組相比,ICA低、高劑量組以及Los組心肌細胞排列趨于整齊,無明顯的炎性細胞浸潤(圖3)。

A：Control;B：Model;C：ICA-L;D：ICA-H;E：Los;標尺= 50 μm。

2.4 普魯士藍染色 染色結果顯示,空白組左心室心肌組織中未見明顯棕色顆粒,僅有極微量鐵的沉積;與空白組相比,ISO模型組左心室心肌組織中可見明顯棕色顆粒,鐵沉積明顯。與ISO模型組相比,ICA低、高劑量組以及Los組左心室心肌組織中棕色顆粒減少,鐵離子沉積明顯改善(圖4)。

A：Control;B：Model;C：ICA-L;D：ICA-H;E：Los;標尺= 50 μm。

2.5 小鼠左心室組織中鐵死亡相關蛋白的表達

2.5.1 小鼠左心室組織中4-HNE蛋白的表達 Western blot結果顯示,與空白組相比,ISO模型組小鼠左心室組織中4-HNE蛋白表達明顯上調48.3%(P<0.05)。與ISO模型組比較,ICA低、高劑量組及Los組左心室組織中4-HNE蛋白表達分別下調39.6%、84.3%、94.9% (P<0.05,圖5)。

*：與空白組比較,P<0.05;#：與ISO組比較,

2.5.2 小鼠左心室組織中SLC7A11、GPX4蛋白的表達 Western blot結果顯示,與空白組相比,ISO模型組小鼠左心室組織中SLC7A11、GPX4蛋白表達分別下調57.4% 、 40.3%(P<0.05)。與ISO模型組比較,ICA低、高劑量組及Los組左心室組織SLC7A11分別上調148.8%、228.6%、292.0% (P<0.05);GPX4分別上調38.8%、81.7%、134.5% (P<0.05,圖6)。

*：與空白組比較,P<0.05;#：與ISO組比較,

2.5.3 小鼠左心室組織中ACSL4、LPCAT3蛋白的表達 Western blot結果顯示,與空白組相比,ISO模型組小鼠左心室組織中ACSL4、LPCAT3蛋白表達分別上調41.5% 和40.0% (P<0.05)。與ISO模型組比較,ICA低、高劑量組及Los組左心室組織中的ACSL4分別下調31.1%、40.2%、39.1% (P<0.05);LPCAT3分別下調25.7%、59.3%、43.9% (P<0.05,圖7)。

*：與空白組比較,P<0.05;#：與ISO組比較,

2.5.4 小鼠左心室組織中TFR1、DMT1蛋白的表達 Western blot結果顯示,與空白組相比,ISO模型組小鼠左心室組織中的TFR1、DMT1蛋白表達分別上調114.0%和43.8%(P<0.05)。ICA與ISO模型組比較,低、高劑量組及Los組左心室組織中的TFR1分別下調140.3%、166.5%、141.3%(P<0.05);DMT1分別下調32.5%、46.5%、39.7%(P<0.05,圖8)。

*：與空白組比較,P<0.05;#：與ISO組比較,

3 討論

HF是大多數心血管疾病的終末期,臨床表現主要為肺水腫、呼吸困難以及乏力等[8]。本研究中ISO模型組小鼠的LVEF、LVFS明顯降低,而HMI、LVMI明顯升高;同時ISO模型組病理結果顯示心肌細胞形態排列紊亂,炎性細胞浸潤明顯。提示本實驗條件下成功制備小鼠心力衰竭模型。而給予ICA、陽性藥Los干預后,明顯改善ISO所致小鼠LVEF、LVFS、HMI、LVMI及左心室病理的變化。提示ICA能夠抑制ISO引起小鼠心室重構,改善心力衰竭。

鐵死亡是一種鐵依賴性細胞死亡形式[9]。本研究通過普魯士藍染色發現,在ISO組小鼠心肌組織中棕色顆粒明顯增多,鐵沉積含量顯著增加;然而給予低、高劑量ICA以及Los干預后,左心室組織的棕色顆粒明顯減少,鐵沉積含量顯著降低。提示低、高劑量ICA以及Los能抑制ISO所導致的左心組織的鐵離子增多。

三價鐵離子與細胞膜上的轉鐵蛋白(TF)結合形成復合物,由轉鐵受體蛋白1(TFR1)轉運到細胞內還原為二價鐵離子,并由二價金屬離子轉運體(DMT1)轉運后通過Fenton reaction導致脂質自由基生成增多引起脂質過氧化,引起鐵死亡[10-11]。本研究發現ISO組左心室組織中TFR1、DMT1蛋白表達上調;然而給予低、高劑量ICA以及Los干預后,左心室組織中TFR1、DMT1蛋白表達降低。提示ICA改善心衰小鼠左心室功能減退與病理損傷可能與其下調左心室組織TFR1、DMT1蛋白表達,抑制細胞鐵離子過載,減輕鐵死亡有關。

脂質過氧化標志物4-羥壬二酸酯(4-HNE)是由脂肪酸過氧化產生的有害代謝產物。研究證明,在心肌缺血/再灌注模型中其表達增多可導致心功能障礙[12]。本研究發現ISO組左心室組織中4-HNE蛋白表達上調;然而給予低、高劑量ICA以及Los干預后,左心室組織中4-HNE蛋白表達降低。谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)具有催化脂質氫過氧化物的還原作用[13]。值得注意的是,溶質載體家族7成員11(SLC7A11)介導的胱氨酸/谷氨酸轉運體(System Xc-)是谷胱甘肽(GSH)合成中重要的轉運載體,GSH作為細胞內的抗氧化劑,具有很強的抗氧化作用。抑制SLC7A11的表達時會導致GPX4的活性和穩定性被破壞以及GSH的合成減少,從而引起細胞脂質過氧化物的積聚促使細胞發生鐵死亡[14-15]。此外,長鏈脂酰輔酶A合成酶4(ACSL4)和溶血卵磷脂酰基轉移酶3(LPCAT3)是脂質代謝的兩種關鍵代謝酶,可調控細胞膜中多種不飽和脂肪酸的生物合成,但其蛋白表達的過度上調可促使細胞脂質過氧化物生成增多,導致細胞膜通透性增強,促進細胞發生鐵死亡[16]。因此,SLC7A11、GPX4、ACSL4、LPCAT3常常被認為是鐵死亡發生的關鍵調控性蛋白。本研究中,ISO組左心室組織中SLC7A11、GPX4的蛋白表達降低;ACSL4、LPCAT3的蛋白表達上調,給予低、高劑量ICA以及Los干預后,左心室組織中SLC7A11、GPX4的蛋白表達上調;ACSL4、LPCAT的蛋白表達下調。表明ICA改善心衰小鼠左心室功能與病理變化可能與其上調SLC7A11/GPX4軸及抑制ACSL4、LPCAT3蛋白的表達,減輕脂質過氧化改善鐵死亡有關。

綜上所述,ICA能夠改善ISO誘導的小鼠心力衰竭,其機制至少可能與抑制鐵離子過載以及上調SLC7A11/GPX4軸抑制鐵死亡有關。