基于噬菌體展示技術(shù)醛固酮特異性抗體的篩選

王素娟，田曉平，趙巧輝，王天云

(1.鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司,河南 鄭州 450016;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

噬菌體展示技術(shù)是將編碼外源蛋白或多肽的DNA片段插入能編碼噬菌體衣殼蛋白的基因中,從而將蛋白或多肽展示在噬菌體表面的一種技術(shù)[1-4]。噬菌體展示技術(shù)不僅實現(xiàn)了表型與基因型相結(jié)合,也實現(xiàn)了蛋白的多樣化展示與高通量篩選,從而在抗體藥物研發(fā)、小分子多肽研究及分子診斷領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[5-7]。醛固酮(aldosterone,ALD)是一種在血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)和血漿中K+含量增加、Na+減少等生理刺激下由腎上腺皮質(zhì)分泌的鹽皮質(zhì)激素[8-10]。研究發(fā)現(xiàn),ALD在體內(nèi)水平的升高可誘發(fā)原發(fā)性醛固酮增多癥(primary aldosteronism,PA)、糖尿病、慢性腎臟病等多種代謝性相關(guān)疾病。目前,臨床上常使用放射免疫法或化學發(fā)光免疫法來檢測血清或血漿中腎素活性、AngⅡ和ALD水平[11-12],但檢測過程中可出現(xiàn)假陽性率高的現(xiàn)象;特別是在腎素水平低至無法檢測的情況下,ALD水平也會受到影響而低于正常水平[12-14]。因此,為更好地實現(xiàn)ALD在ALD相關(guān)代謝性相關(guān)疾病早期診斷中的靈敏度與準確性,尋找高親和力、高競爭性的特異性ALD抗體十分重要。本研究利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建單鏈片段(single-chain variable fragment,ScFv)噬菌體文庫,篩選高親和力、高競爭性的兔ALD單抗,以期為后續(xù)ALD診斷試劑盒的研發(fā)提供原材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、細胞株、菌種及載體質(zhì)粒

5只健康清潔級新西蘭大白兔,雌性,6周齡,購自北京大學醫(yī)學部;人胚胎腎(HEK) 293細胞株購自美國Thermo Fisher公司,大腸桿菌TG1菌株購自湖南豐暉生物科技有限公司;噬菌粒載體pcomb3xss由本實驗室保存;超級噬菌體(superPhage)購自美國Phageomics公司,并由本實驗室制備和保存。

1.1.2 主要試劑與儀器

ALD、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司,TRIzol試劑購自瑞士Roche公司,限制性核酸內(nèi)切酶SifI、KasI、BamHI購自美國Thermo公司,SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis SuperMix、T4 DNA Ligase購自美國Invitrogen公司,PrimeSTAR?Max DNA polymerase購自日本TaKaRa公司,ALD-血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)由鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司偶聯(lián)合成并保存,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;1 mm電擊杯購自美國BIO-RAD公司,電轉(zhuǎn)儀購自美國BIO-RAD公司,聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀購自美國Thermo公司,超凈工作臺購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;落地式離心機購自美國Thermo公司,酶標儀購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.2 動物免疫組織的獲取

將抗原ALD-KLH稀釋至 2 mg·L-1,采用背部多點注射方法對5只新西蘭大白兔進行首次免疫,免疫劑量為每只1 mg;每隔2周進行1次免疫,且免疫劑量減少50%。從第3次免疫開始,每次免疫1周后采集大白兔耳緣靜脈血,使用包被0.25 mg·L-1ALD-BSA抗原的化學發(fā)光板,采用間接法和免疫競爭法測定血清滴度;根據(jù)結(jié)果擇優(yōu)選取效價高、特異性好的大白兔;然后,采用放血處死法將其處死,摘取其脾臟和骨髓等組織保存在液氮中備用。

1.3 ScFv噬菌體文庫的構(gòu)建

1.3.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

從液氮中取出脾臟和骨髓,并在低溫下研磨至粉末,采用TRIzol試劑一步法提取總RNA,用紫外分光光度計測定RNA濃度,并根據(jù)濃度取100 ng總RNA,用質(zhì)量分數(shù)為2%瓊脂糖凝膠鑒定RNA質(zhì)量;按照SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis SuperMix試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。

1.3.2 引物設(shè)計及目的片段擴增

設(shè)計連接輕鏈可變區(qū)(variable region of light chain,VL)和重鏈可變區(qū)(variable region of heavy chain,VH)的連接肽(linker)上下游引物:上游引物序列為5′-CCTTCTAGATCTCCTTGGTGGGGGTGGTGGCGGGCTCGTAGGATCTCCAGCTCGGTCCC-3′,下游引物序列為5′-AGGAGACCACCGCCACCGAGCCCGCCACCACCCCCACCCAGTCGGTGGAGGAG-3′;設(shè)計可引入酶切位點并能完成ScFv片段擴增的上下游引物:上游引物序列為5′-CTGCTGCTGGGCCCAGGCGGCC-3′,下游引物序列為5′-GAGGAGGAGGGCCGGCCTGGCC-3′。利用實驗室保存的PCR上下游簡并引物擴增其VL和VH片段。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板2.5 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃變性15 s,56 ℃變性15 s,72 ℃變性25 s,共30個循環(huán);然后,核酸純化回收目的片段,按摩爾比11進行合并。

1.3.3 單鏈ScFv制備

使用引物ScFv-1/linker-1、ScFv-2/linker-2分別擴增回收產(chǎn)物。反應(yīng)條件為:95 ℃變性15 s,56 ℃變性15 s,72 ℃變性25 s,共20個循環(huán);回收目的片段1。使用引物ScFv-1/ScFv-2進行VL與VH的相互搭橋拼接和擴增;反應(yīng)條件為:95 ℃變性15 s,68 ℃變性 1 min 15 s,共10個循環(huán),回收目的片段2。將目的片段2與噬菌粒載體Pcomb3xss分別使用限制性內(nèi)切酶SifI酶切,連接后電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1菌株(圖1);然后,用2xYT培養(yǎng)液進行梯度倍比稀釋,并涂布含氨芐抗性的平板,37 ℃培養(yǎng)過夜;計數(shù)單克隆菌落并計算庫容。剩余培養(yǎng)后的菌液加入體積分數(shù)80%的甘油凍存至-80 ℃冰箱,作為初級抗體庫。隨機挑取氨芐抗性平板上的10個單克隆進行PCR鑒定并測序,用IMGT軟件進行序列分析。

圖1 ALD噬菌體文庫構(gòu)建示意圖

1.4 噬菌體文庫淘選

使用輔助噬菌體superPhage侵染初級抗體庫,37 ℃侵染0.5 h后,30 ℃過夜震蕩培養(yǎng)后;次日,5 000 r·min-1離心收集上清,獲得重組噬菌體抗體。將抗原ALD-BSA稀釋至20 mg·L-1,包被至免疫管中,4 ℃過夜孵育;將噬菌體抗體上清使用20 g·L-1脫脂奶粉封閉后加入免疫管中,室溫孵育2 h,用的Gly-HCl(pH=2.5)進行洗脫,加入Tris-HCl(pH=7.4)中和洗脫液至pH=7.0后,再加入宿主菌TG1(OD600=0.5),振蕩培養(yǎng)1 h;然后,加入superPhage侵染30 min,再振蕩培養(yǎng)1 h,5 000 r·min-1離心,然后用2xYT-A+K+輕懸細胞沉淀,30 ℃過夜培養(yǎng)。采用同樣方法篩選,逐輪降低抗原包被濃度,篩選至少3輪。自2輪淘洗開始,利用ALD-BSA抗原與噬菌體文庫特異結(jié)合的原理,對洗脫下來的噬菌體應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)進行多克隆滴度測定,并將培養(yǎng)后的菌液梯度稀釋后涂布平板上,計數(shù)單克隆,計算出庫量及產(chǎn)出比(投入量/產(chǎn)出量),鑒定噬菌體文庫質(zhì)量;挑取6個克隆進行序列測定,使用IMGT軟件分析監(jiān)控淘洗序列多樣性。

1.5 噬菌體單克隆的制備及檢測

1.5.1 噬菌體單克隆的制備

挑取出庫平板上200個單克隆菌株,接種于含氨芐抗生素的2xYT培養(yǎng)基中,37 ℃、250 r·min-1震蕩過夜培養(yǎng);次日,按120比例對接菌液于含氨芐抗生素的2xYT培養(yǎng)基中,3 h后加入superPhage侵染30 min,再振蕩培養(yǎng)1 h,更換2xYT-A+K+培養(yǎng)基,16 ℃、250 r·min-1過夜震蕩培養(yǎng)。

1.5.2 噬菌體單克隆檢測

將檢測抗原ALD-KLH稀釋至0.1 mg·L-1,然后包被在化學發(fā)光板上,4 ℃孵育過夜,用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌2遍后,BSA 37 ℃封閉 2 h;洗滌后加入制備好的單克隆噬菌體,37 ℃孵育0.5 h;洗滌后加入二抗M13-HRP,37 ℃孵育0.5 h;洗滌后加入顯色試劑,使用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.6 構(gòu)建真核表達載體HEK-293細胞表達

將篩選得到的克隆序列插入至pCMV3表達載體,提取質(zhì)粒后使用瞬時轉(zhuǎn)染方法進行HEK293細胞轉(zhuǎn)染;1周后,收取上清,應(yīng)用親和層析純化及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳鑒定其純度及表達量。

2 結(jié)果

2.1 5只大白兔免疫血清效價

5只大白兔在第5次免疫后,間接法檢測其血清效價結(jié)果顯示,4#、5#大白兔血清在稀釋32 000倍后,吸光度值仍>10 000。免疫競爭法檢測結(jié)果顯示,5#大白兔血漿樣本低值與高值的比值為21,優(yōu)于其他大白兔。結(jié)果見圖2。因此,選取5#大白兔進行噬菌體文庫構(gòu)建。

A:間接法;B:免疫競爭法。

2.2 ALD噬菌體文庫構(gòu)建與多樣性鑒定結(jié)果

常規(guī)PCR擴增出VL及VH基因片段,大小350 bp左右;經(jīng)搭橋拼接成ScFv(VL+VH)后,瓊脂凝膠電泳分析可看到750 bp左右大小條帶(圖3),與最初設(shè)計的片段大小一致。ScFv經(jīng)酶切連接電轉(zhuǎn)至大腸桿菌TG1中,構(gòu)建一個庫容為4.73×108cfu·mL-1的噬菌體文庫;挑取10個克隆分析結(jié)果顯示,10條序列均不相同。

圖3 ALD噬菌體文庫ScFv拼接后瓊脂凝膠電泳條帶

2.3 ALD噬菌體文庫淘洗及多克隆檢測結(jié)果

噬菌體文庫3輪篩選結(jié)果顯示,出庫量和產(chǎn)出比逐輪升高(表1)。每輪測序6個單克隆,經(jīng)IMGT分析顯示,3輪淘洗6條序列均不相同。

表1 噬菌體文庫3輪篩選出庫量和產(chǎn)出比

2.4 ALD噬菌體文庫多克隆檢測結(jié)果

富集淘洗過程中,每輪使用化學發(fā)光免疫法對ALD噬菌體進行檢測,結(jié)果顯示,淘洗3輪后,噬菌體文庫在校準品和臨床樣本的檢測中競爭梯度均較好,達到2倍梯度,結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 噬菌體文庫校準品競爭檢測結(jié)果

圖5 噬菌體文庫臨床樣本競爭檢測結(jié)果

2.5 ALD單克隆噬菌體檢測結(jié)果

3輪淘洗出庫平皿挑取300個單克隆,制備單克隆噬菌體,并使用化學發(fā)光免疫法進行ELISA檢測;結(jié)果顯示,300個克隆中陽性率達100%(圖6),校準品競爭檢測陽性克隆42個(圖7),篩出率14%;42個陽性克隆進一步進行臨床樣本競爭檢測,篩出16株單克隆符合要求(圖8);將16株進行復(fù)測,2次檢測結(jié)果一致(圖9)。AD185、AD277抗體在校準品及臨床樣本競爭中均表現(xiàn)出比陽性對照高出2倍的競爭優(yōu)勢。

圖6 噬菌體單克隆檢測初篩

圖7 噬菌體單克隆校準品競爭檢測

圖8 噬菌體單克隆競爭檢測

圖9 噬菌體單克隆臨床樣本競爭復(fù)測

2.6 HEK-293細胞真核表達載體表達及純化鑒定

將高競爭性的6株抗體經(jīng)過瞬時轉(zhuǎn)染,純化后進行10% SDS-PAGE還原膠電泳,結(jié)果顯示,在重鏈50 000及輕鏈25 000位置均有條帶,結(jié)果見圖10。

圖10 高競爭性的6株抗體SDS-PAGE電泳條帶

3 討論

ALD是鹽皮質(zhì)激素中一種重要的類固醇激素,研究表明,其除了調(diào)節(jié)體內(nèi)鈉鉀平衡,還與繼發(fā)性高血壓的典型代表PA有關(guān)[15-17]。PA是由于腎上腺皮質(zhì)增生或腫瘤分泌過多ALD而引起潴鈉排鉀,血容量上升,導致血壓升高同時腎素活性被抑制的一種疾病;而ALD分泌過多則會導致心血管疾病、腎功能損害、胰島素抵抗等[18-19]。研究表明,ALD的合成主要受腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)、鉀離子的調(diào)節(jié),同時也受促腎上腺皮質(zhì)激素調(diào)控,而RAAS通常在血管內(nèi)容量耗盡或腎動脈灌注減少的情況下被激活,通過促進遠端腎小管和集合管中鈉和水的再吸收,使血管內(nèi)容量增加[20-21]。ALD過度激活腎鹽皮質(zhì)激素受體可導致血管內(nèi)容量擴張,最終導致高血壓伴或不伴低血鉀的風險[22-24]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),ALD水平異常不僅誘發(fā)高血壓,還容易導致心血管疾病、慢性腎病、糖尿病、肥胖等疾病的產(chǎn)生[18,25-26]。因此,機體內(nèi)ALD水平的準確檢測對預(yù)防高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化等代謝性慢性疾病至關(guān)重要。

ALD檢測方法從最初的紙層析生化反應(yīng)比色法到放射免疫技術(shù),再發(fā)展到2008年利用質(zhì)譜法開發(fā)的金標準,但質(zhì)譜法難度高、價格昂貴,因此,化學發(fā)光免疫法便應(yīng)運而生[17,27]。目前,意大利DiaSorin公司在2012年底推出的ALD檢測試劑盒是唯一通過CDFA認證的全自動化學發(fā)光平臺的進口試劑盒,但其成本昂貴;因此,急需研發(fā)一款靈敏度高、特異性好的試劑盒以改變現(xiàn)狀。本研究通過將抗原ALD-KLH 背部注射5只新西蘭大白兔進行首次免疫,取脾臟和骨髓等組織,使用常規(guī)PCR擴增出VL及VH基因片段,大小350 bp左右,經(jīng)搭橋拼接成ScFv(VL+VH)后,瓊脂凝膠電泳分析可看到 750 bp左右大小條帶,與最初設(shè)計的片段大小一致。ScFv經(jīng)酶切連接電轉(zhuǎn)至大腸桿菌TG1中,構(gòu)建一個庫容為4.73×108cfu·mL-1的噬菌體文庫;挑取10個克隆,分析結(jié)果顯示,10條序列均不相同,說明該文庫多樣性較好,達到繼續(xù)篩選標準。對噬菌體文庫進行3輪篩選結(jié)果顯示,出庫量和產(chǎn)出比逐輪升高,說明噬菌體文庫得到了富集。然后,每輪測序6個單克隆,經(jīng)IMGT分析后,均為不同的抗體序列,說明文庫保持了較高的序列多樣性。經(jīng)3輪淘洗出庫平皿挑取300個單克隆,制備單克隆噬菌體,ELISA結(jié)果顯示,300個克隆中陽性率達100%,校準品競爭檢測陽性克隆42個,篩出率14%,42個陽性克隆進一步進行臨床樣本競爭檢測,篩出16株單克隆符合要求,將16株進行復(fù)測,2次檢測結(jié)果一致;送測序列經(jīng)IMGT軟件分析,優(yōu)選6條抗體序列進行構(gòu)建表達;將高競爭性的6株抗體經(jīng)過瞬時轉(zhuǎn)染,純化后進行10% SDS-PAGE還原膠電泳,結(jié)果顯示,在重鏈50 000及輕鏈25 000位置均有條帶,表明已成功篩選構(gòu)建出高競爭性且表達量較好的抗體。

4 結(jié)論

通過噬菌體展示技術(shù)可成功篩選出ALD抗體,這為小分子抗體的發(fā)現(xiàn)提供了一種參考方法。篩選出的AD185、AD277抗體在校準品及臨床樣本競爭中,均表現(xiàn)出比陽性對照高出2倍的競爭優(yōu)勢,為ALD檢測試劑盒原材料的開發(fā)提供了可能性,對ALD檢測靈敏度的提高有重要意義。