炎癥因子對再生障礙性貧血免疫機制的影響研究進展

張萍心，柴立民，馮桂宇，李東陽，孫 嵩，劉 蔚，張英凱

(北京中醫藥大學東直門醫院重點實驗室,北京 100700)

再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是一種由多種因素導致的骨髓造血功能衰竭,以骨髓中造血細胞減少和外周血細胞減少為特征,臨床以貧血、出血、發熱以及感染為主要表現,發病原因涉及物理、化學、生物、環境以及免疫等因素[1-4]。AA與自身免疫反應相關,骨髓微環境中效應性T細胞激活并浸潤,伴隨著大量炎癥因子的產生,導致造血干/祖細胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs)免疫損耗[5],而造血干細胞異常是造成全血細胞減少的重要因素。目前造血干細胞移植和免疫抑制治療(immunosuppressive therapy,IST)是AA的主要治療策略[6],但是IST治療后的AA患者中仍有60%無反應或復發,需要進一步治療[7]。因此,本文從調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)減少、凋亡相關因子(factor-related apoptosis,Fas)/凋亡相關因子配體(factor-related apoptosis ligand,FasL)信號通路導致造血干細胞減少、炎癥因子刺激微RNAs(microRNAs,miRNAs)誘導靶基因表達異常與AA 患者的Treg 功能缺失等方面綜述其發病機制,以期為臨床治療提供思路與方法。

1 AA中Treg凋亡與免疫紊亂

Treg在誘導和維持免疫穩態和自身免疫耐受中起著重要作用,是通常所稱的CD4+CD25+Foxp3+T細胞,具有免疫抑制能力,起到平衡免疫系統和抗炎作用[8]。Treg有2個不同表型:Treg A(幼稚的表型,具有低增殖指數)和Treg B(記憶表型,具有中/高增殖指數,與IST的反應相關)[9]。Treg B的主要特征是在炎癥微環境中高表達Fas,以及對FasL介導的細胞凋亡表現出較高的敏感性[10]。AA 患者外周血中 Treg水平降低,但Treg A比例較健康人高,而Treg B比例較健康人低[11]。白細胞介素(interleukin,IL)-2是Treg的關鍵生存因子,是一種多效能細胞因子,其通過促進叉頭框蛋白p3(forkhead box protein p3,Foxp3)的表達和調節細胞因子的產生來維持Treg的功能[12]。研究發現,環孢素A聯合抗胸腺細胞免疫球蛋白治療AA患者后,CD4+CD25+T細胞水平逐步恢復正常,這可能是通過抑制T細胞表達IL-2受體,并抑制T淋巴細胞構成,從而幫助AA患者恢復造血功能[13]。Foxp3是一種轉錄因子,是Treg的重要標志物,同時也參與Treg的分化[14]。Foxp3+Treg是CD4+T細胞的一個亞群,對維持和調節免疫反應及自身免疫耐受至關重要。Treg B中存在IL-2/信號轉導及轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)5通路相關基因和細胞周期調控相關基因,高水平的IL-2可以刺激Treg B高表達抗凋亡基因B淋巴細胞瘤(B-cell lymphbma,Bcl)-2,Bcl-2磷酸化后被激活,進而拮抗Fas/FasL信號轉導通路,從而使Treg在炎癥微環境中保持數量穩定和正常增殖分化,并發揮免疫調控作用。有研究采用重組人粒細胞集落刺激因子聯合免疫抑制劑對AA并發感染患者進行治療,結果發現,患者血漿中Fas mRNA、Bcl-2 mRNA表達水平下降,說明通過抑制Fas、Bcl-2蛋白表達可以達到治療AA的目的[15]。自身免疫性疾病患者體內IL-2水平偏低,因此,采用低劑量IL-2治療可以補充患者血漿中IL-2的不足,減少Treg穩態紊亂和耐受性破壞,從而對抗炎癥反應,因此,Treg的存活和生長與IL-2關系密切[16]。另有研究報道,AA患者中Treg B細胞數量減少,CD4+CD25+Foxp3+Treg表達呈降低趨勢,導致免疫調控功能異常[17]。由此可見,AA患者骨髓病變微環境存在免疫紊亂,導致自身免疫耐受穩態被破壞,誘發異常自身免疫應答反應,造成骨髓細胞免疫損傷,抑制骨髓造血功能。在AA患者中,Treg B數量減少且功能受損,無法有效抑制效應性T細胞的活化,因此,增加AA患者中Treg B數量將有助于維持免疫平衡,以便更好地進行IST治療?？傊?Treg對AA患者的治療至關重要。

2 炎癥因子與Treg 功能缺失

炎癥因子是重要的造血調節因子,促炎細胞因子可以通過激活免疫細胞的功能來發揮免疫調節作用[18]。CD4+細胞包括輔助性T細胞(Thelper cell,Th)1細胞[分泌干擾素(interferon,IFN)-γ、IL-2等]、Th2細胞(分泌IL-6、IL-10等)、Trey(分泌IL-10、轉化生長因子-β等)和Th17細胞(分泌IL-17等),這些細胞均在自身免疫中起關鍵作用[19],其中,Treg功能缺失與外周血和骨髓中Treg數量減少、遷移能力降低以及免疫抑制缺陷有關。miRNAs可以通過凋控Treg功能、體內免疫平衡和表型穩態來干預自身炎癥免疫應答[20],能夠阻礙mRNA的翻譯和穩定性,控制炎癥、細胞凋亡等過程[21]。在免疫反應中,miRNAs通過靶向不同的炎癥途徑發揮重要作用[22]。miRNAs 是長度約為22 個核苷酸的非編碼RNA,基因組DNA通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄成初級miRNAs,初級miRNAs在細胞質中經過剪切和加工形成miRNAs;miRNAs與目標基因編碼的mRNA結合形成誘導沉默復合物,導致編碼目標蛋白的mRNA翻譯受到抑制和降解[23-24]。多種miRNAs簇對Treg抑制的自身免疫應答反應功能具有調控作用,其中miR-146a是最早被發現有免疫反應調節作用的miRNAs,廣泛表達于Treg,并與Treg的免疫抑制功能密切相關。此外,miR-146a作為抗炎介質,可以負調控IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α的表達[25],阻止CD4+T細胞分泌IL-6向Th17分化,抑制促炎細胞因子IFN-γ的產生。STAT1是IFN-γ受體信號轉導下游的關鍵轉錄因子,也miR-146a的靶基因,參與IFN-γ受體信號通路,并正向調節Th1細胞分化。miR-146a缺失會導致STAT1基因的異常高表達和激活,并促進促炎細胞因子的產生(如IFN-γ和IL-17A),抑制抗炎細胞因子(如IL-4)的產生[26]。此外,STAT1激活會選擇性抑制細胞因子信號轉導抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)的活化,而SOCS1是IFN-γ受體信號轉導通路下游銜接分子STAT1磷酸化的重要負調節因子,其活化受到抑制會誘發Th1介導的炎癥免疫應答反應[27]。miR-10a在Treg中呈現高表達,其靶基因是轉錄因子Bcl-6。Bcl-6活化后可以刺激炎癥因子IL-17A的表達和分泌,從而促進Th17的增殖和分化。miR-10a 靶向抑制Bcl-6基因的翻譯和表達,減緩因炎癥反應而激活誘導性Treg向濾泡性Treg表型的轉化,抑制Treg向Th17轉分化,進而恢復Treg的免疫調控功能,延緩或消除炎癥所導致的組織和器官損傷[28]。Treg特異性轉錄因子Foxp3與嗜酸性粒細胞(eosinophil,EOS)、核基質結合蛋白SATB1、干擾素調節因子4(interferon regulatory factor 4,IRF4)等協同調控Treg 的轉錄表型和免疫抑制特性。有研究顯示,miR-17表達于Treg的miRNA上,特異性靶向EOS和其他Foxp3共調節因子。IL-6通過激活缺氧誘導因子-1α (hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)誘導miR-17轉錄。高表達的miR-17特異性靶向Foxp3協同調節因子EOS、IRF-4和SATB1,干擾Foxp3的翻譯和表達,從而抑制Treg的免疫抑制功能,誘導效應T細胞分泌炎癥細胞因子,啟動自身免疫應答,造成組織和器官的損傷[29]。

以上研究表明,Treg特異性表達的miRNAs對Treg 的免疫調控具有干預作用,在維持免疫平衡和抑制炎癥反應方面發揮重要作用。AA患者的發病與miRNAs表達異常有關,通過調控炎癥因子和免疫細胞的功能,有助于減少免疫損傷和炎癥反應,為治療AA提供新的方向。

3 炎癥因子與造血干細胞損傷

AA患者骨髓衰竭是由于HSPCs丟失所致,而HSPCs丟失又是由免疫紊亂和炎癥而引起[30]。HSPCs 的損傷與Fas/FasL信號通路介導的細胞凋亡密切相關性,Fas/FasL信號通路介導的細胞凋亡在AA中起重要作用[31]。Fas是一種細胞表面受體,通過與天然配體FasL相互作用啟動細胞凋亡。在正常情況下,Fas/FasL系統在維持機體代謝平衡中起著重要作用。Fas廣泛存在于多種組織中, 而其配體FasL的表達僅存在于免疫系統內的細胞,如活化的T細胞和自然殺傷細胞。在AA患者中,活化的T細胞過度增殖并通過細胞凋亡機制破壞骨髓干細胞,影響造血過程,導致全血細胞減少[32]。細胞毒性T細胞通過IFN-γ和TNF-α增強Fas受體的表達,從而促進造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSCs)的凋亡[33]。研究表明,Fas受體在造血祖細胞的增殖和分化過程中均有表達,并在所有造血祖細胞的遠端分化過程中起負調節作用[34]。CD34+是造血祖細胞的表面標志,研究顯示,CD34+細胞的功能間接代表了造血干細胞的功能,而AA的特征之一是CD34+細胞凋亡,因此,所有細胞系的成熟造血祖細胞減少或缺失均會導致骨髓細胞減少和全血細胞減少[35]。AA患者的CD8+T細胞中的FasL表達增高,Fas抗原表達在CD34+細胞表面,并通過Fas/FasL協同誘導CD34+細胞凋亡[35]。研究發現,AA患者的效應T細胞增多,骨髓來源的CD8+T細胞中轉化生長因子-β和FasL的表達均增高,表明AA患者的T細胞與HSPC有相關性[36]。此外,骨髓微環境中不同炎癥因子在調節造血過程中起重要作用,其中IFN-γ和TNF-α在破壞AA患者的骨髓干細胞中起主要作用。研究表明,IFN-γ對造血干細胞具有雙重作用[37]。短期接觸IFN-α和IFN-γ的情況下,HSCs退出靜止狀態,開始進入細胞周期進行分裂分化,生成骨髓,這一過程增強了對急性感染的應答;而長期暴露于IFN則會導致DNA損傷增加,激活凋亡途徑,損傷造血干細胞功能和自我更新能力。因此,IFN在HSCs中的作用較為復雜[38]。IFN-γ能促進Fas介導的造血細胞凋亡,在免疫介導的骨髓衰竭中,活化的攜帶FasL的細胞毒性T細胞在局部骨髓環境中擴增,驅動Fas上調骨髓中的HSCs成分,形成異常免疫反應的關鍵組成部分,增強HSCs中Fas表達和Fas介導的細胞凋亡,導致HSCs損傷[39]。TNF與抑制HSCs的生長和誘導HSCs的凋亡有關,并可間接改變對HSCs穩態至關重要的骨髓微環境[40]。有研究顯示,TNF-α的功能與IFN-γ相似,TNF-α在AA患者骨髓內的表達較健康人高,TNF-α通過刺激效應T細胞表達IFN-γ來影響T細胞分化或活化,進而導致骨髓被破壞[41]。有研究顯示,在急性與慢性刺激下,IL-6可能對造血產生相反的影響[42]。因此,骨髓微環境下,不同水平的炎癥因子以及Fas/FasL系統在AA發病機制中的作用與HSCs凋亡密切相關,可導致AA并引發骨髓破壞。

4 結論

AA是一種難治性血液病,其病理生理機制尚不清楚,被廣泛接受的機制是免疫系統失調導致的遺傳易感宿主的HSPCs被自身反應性T細胞破壞。炎癥細胞因子激活Fas/FasL信號轉導通路,誘導炎癥微環境中對FasL敏感的Treg B細胞凋亡,最終導致Treg數量減少。Treg特異性表達的miRNAs靶向抑制特定靶基因的翻譯和表達,干預Treg的免疫抑制功能。miRNAs在調節免疫反應和炎癥中起著重要作用,影響機體免疫耐受穩態。因此,Treg細胞數量減少和功能缺失是AA患者對標準IST治療不反應的關鍵病理機制。調控炎癥因子和miRNAs的表達可減少炎癥反應和免疫損傷,為AA患者的治療提供新的方向。然而,目前AA患者的治療仍存在一些問題,如治療效果不穩定、治療成本高等。為了提高AA患者臨床治療的有效性,進一步研究AA發病的效應靶點和作用機制具有重要意義。