蛋白酶N1對小鼠心肌細胞增殖的作用及機制

趙宗磊，陳頌歌，孫鎖峰，王麗霞

(河南省人民醫院心內科,河南 鄭州 450000)

近年來,心肌梗死及其導致的心力衰竭發病率逐年上升[1]。心肌細胞受損后增殖能力明顯降低,有研究發現,靶向內源性基因可促進心肌細胞原位增殖,促進心肌細胞再生,進而改善心肌梗死后心功能[2]。蛋白酶N1(protein kinase N1,PKN1)是一種應激反應蛋白激酶,是磷酸鳥苷結合蛋白的下游作用靶點[3]。PKN1可發揮信號傳導作用,其活性異常與多種人類疾病及其病理發展過程密切相關,如肌萎縮性脊髓側索硬化癥及動脈損傷后再狹窄[4-5]。有研究表明,PKN1在心臟中起保護作用,干擾PKN1表達可抑制心肌細胞收縮功能[6-7]。然而,PKN1對心肌細胞增殖的作用及機制目前尚不清楚。本研究旨在探討PKN1對小鼠心肌細胞增殖的作用及機制,以期為心肌細胞增殖的調控提供新的靶點,為心肌梗死后心肌損傷的治療提供研究方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

12只健康1日齡C57BL/6雄性小鼠乳鼠,無特定病原級,體質量(4.0±0.2)g,購自鄭州大學醫學檢驗動物中心。所有動物實驗均獲得河南省人民醫院動物研究委員會的批準。

1.2 主要試劑與儀器

動物用異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司,PKN1干擾片段及對照片段購自廣州銳博生物技術有限公司,PKN1干擾腺病毒及空載腺病毒購自漢恒生物科技(上海)有限公司,胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素、達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbeco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、胎牛血清購自美國Gibco公司,PKN1抗體、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)抗體、Ki-67抗體、cyclin D1抗體購自英國Abcam公司,β-actin抗體、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗購自上海普邁生物科技有限公司,RNA反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司,RNA提取試劑盒、SYBRs Premix Ex TaqTM試劑盒購自寶生物工程 (大連) 有限公司;熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀購自瑞士Roche公司,熒光共聚焦顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司,電泳槽、電轉膜裝置購自美國Bio-Rad公司,細胞培養箱、低溫高速離心機、冰凍切片機購自美國Thermo Fisher公司;所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司設計合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠心肌細胞分離培養及分組

使用異氟烷麻醉1日齡小鼠2只,分離心室并切成小塊,用胰蛋白酶37 ℃消化2次,每次消化15 min,離心后收集細胞沉淀。將細胞沉淀重懸于含體積分數10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM中,培養于100 mm細胞培養皿中,置于37 ℃、含體積分數5%CO2細胞培養箱中培養2 h。孵育2 h后,收集上清液中的小鼠心肌細胞,并接種于6 cm細胞培養皿,分為對照組和干擾組,每組5個細胞培養皿。干擾組心肌細胞轉染PKN1干擾片段,對照組細胞轉染對照片段,轉染6 h后更換培養基,繼續培養24 h后收集細胞進行后續實驗。

1.3.2 動物分組與處理

按照隨機數字表法將10只小鼠分為正常組和觀察組,每組5只。觀察組小鼠于心臟原位注射 PKN1干擾腺病毒(1×109PFU),正常組小鼠于心臟原位注射空載腺病毒(1×109PFU),由母鼠喂養至7 d后進行后續實驗。

1.3.3 免疫熒光法檢測小鼠心肌細胞增殖能力

取對照組和干擾組心肌細胞,吸去培養基,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌3次,多聚甲醛固定30 min,Triton 破膜后,滴加含體積分數1%牛血清白蛋白的PBS封閉60 min,滴加細胞增殖核抗原Ki-67一抗,室溫下孵育2 h,吸去一抗,PBS洗滌3次,滴加山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗,室溫下孵育1 h,吸去二抗,PBS洗滌3次,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液孵育15 min,使用PBS溶液洗滌,將染色完成的心肌細胞置于共聚焦顯微鏡下進行圖像采集。

取正常組和觀察組小鼠,分離心臟組織,PBS洗滌3次,將心臟組織置于冰凍切片包埋盒中,加入冰凍包埋劑置于-20 ℃中包埋固定。使用冰凍切片機將心臟組織切片(厚3.5 μm),并將心臟組織切片貼于玻璃載玻片中,加入多聚甲醛固定30 min,加入Triton 破膜,滴加含體積分數1%牛血清白蛋白的PBS封閉60 min,滴加細胞增殖核抗原Ki-67一抗,室溫下孵育2 h,吸去一抗,PBS洗滌3次,滴加山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗,室溫下孵育1 h,吸去二抗,PBS洗滌3次,加入DAPI染液孵育15 min,使用PBS洗滌后用甘油封片,將染色完成的心肌組織切片置于共聚焦顯微鏡下進行圖像采集。

共聚焦顯微鏡下可見心肌細胞核被DAPI染成藍色,心肌細胞中心肌結構蛋白 cTnT 陽性表達顯示為綠色熒光,心肌細胞核中Ki-67陽性表達顯示為紅色熒光。每個樣本隨機選取3個視野,視野中Ki-67陽性表達的心肌細胞數與視野中全部心肌細胞數的比值為Ki-67陽性表達率,取均值。Ki-67陽性表達率越高表示細胞增殖能力越強。

1.3.4 實時熒光定量PCR法檢測對照組和干擾組心肌細胞中PKN1 mRNA表達

取對照組和干擾組心肌細胞,根據RNA提取試劑盒說明書提取心肌細胞總RNA。取1 μg總RNA,使用RNA反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。使用實時熒光定量PCR儀進行實時定量PCR,反應體系:SYBRs Premix Ex Taq 5 μL、上下游引物各 0.2 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 3.6 μL;反應條件: 95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃ 退火/延伸 30 s, 共40個循環。PKN1上游引物序列為 5′-AAGCGATGCTACCCAATC-3′,下游引物序列為5′-GCTCTACGGCTCCCAGTT-3′;β-tubulin上游引物序列為5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′,下游引物序列為5′-TTGATGTCACGCACGATTTCC-3′。以β-tubulin為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.3.5 Western blot法檢測對照組和干擾組心肌細胞中PKN1和cyclin D1蛋白表達

取對照組和干擾組心肌細胞,分別加入含蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法裂解緩沖液,4 ℃下裂解 30 min,離心后收集的上清液即為總蛋白提取物。使用二喹啉甲酸法蛋白質定量分析試劑盒測定蛋白濃度,然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結束后將凝膠轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜置于含有體積分數5%牛血清白蛋白的Tris鹽酸緩沖鹽溶液中,室溫封閉2 h,滴加PKN1一抗(滴度為11 000)、cyclin D1一抗(滴度為11 000)、β-tubulin一抗(滴度為15 000),4 ℃孵育過夜。用含吐溫20的Tris鹽酸緩沖鹽溶液洗滌3次,滴加山羊抗兔二抗,室溫下孵育1 h,加入電化學發光顯色液顯影,使用化學發光成像儀成像。應用Image J軟件檢測各條帶灰度值,以β-tubulin為內參,以目的蛋白條帶與內參蛋白灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 小鼠心肌細胞和心肌組織中Ki-67陽性表達率比較

對照組和干擾組心肌細胞中Ki-67陽性表達率分別為(15.44±1.87)%、(8.54±1.33)%,正常組和觀察組小鼠心肌組織中Ki-67陽性表達率分別為(13.70±1.60)%、(5.14±1.00)%。干擾組心肌細胞中Ki-67陽性表達率均顯著低于對照組,差異有統計學意義(t=11.201,P<0.01)。觀察組小鼠心肌組織中Ki-67陽性表達率顯著低于正常組,差異有統計學(t=11.851,P<0.01)。結果見圖1和圖2。

圖1 對照組和干擾組心肌細胞中Ki-67表達情況(免疫熒光法,×200)

圖2 正常組和觀察組小鼠心肌組織中Ki-67表達情況(免疫熒光法,×200)

2.2 對照組與干擾組小鼠心肌細胞中PKN1 mRNA相對表達量比較

對照組和干擾組小鼠心肌細胞中PKN1 mRNA相對表達量分別為1.007±0.025、0.430±0.140。干擾組小鼠心肌細胞中PKN1 mRNA相對表達量顯著低于對照組,差異有統計學意義(t=7.022,P<0.01)。

2.3 對照組與干擾組小鼠心肌細胞中PKN1和cyclin D1蛋白相對表達量比較

對照組和干擾組小鼠心肌細胞中PKN1蛋白相對表達量分別為0.983±0.165、0.317±0.113,對照組和干擾組小鼠心肌細胞中cyclin D1蛋白相對表達量分別為0.747±0.116、0.237±0.055。干擾組小鼠心肌細胞中PKN1和cyclin D1蛋白相對表達量均顯著低于對照組,差異有統計學意義(t=5.762、6.884,P<0.01)。結果見圖3。

圖3 對照組和干擾組小鼠心肌細胞中PKN1和cyclin D1蛋白表達(Western blot)

3 討論

心肌梗死及心肌梗死導致的心力衰竭嚴重威脅著人類健康,是心血管疾病患者的主要死因之一[8]。心肌梗死會導致心肌細胞不可逆的壞死,因此,誘導心肌細胞增殖是改善心肌梗死后心功能的一種有效方法[9]。尋找內源性靶點進而促進心肌細胞增殖被視為一種心肌梗死及心力衰竭后促進心肌組織修復的途徑[10]。PKN1是體內重要的信號調控因子,在心血管疾病如動脈損傷后再狹窄和心肌缺血中發揮著重要的作用[11]。FRANCOIS等[7]研究表明,過表達PKN1可以促進多種細胞如血管平滑肌細胞和上皮干細胞增殖及遷移。但PKN1能否調控心肌細胞增殖目前尚不清楚。Cyclin D1是調控細胞周期G1期的關鍵蛋白,對整個細胞周期調控至關重要[12]。調控細胞周期可以促進腫瘤細胞、干細胞及心肌細胞增殖,對于調控疾病發展非常重要[13-15]。然而,PKN1能否通過調節cyclin D1介導心肌細胞增殖目前尚不清楚。

本研究通過小鼠體內外實驗顯示,干擾組心肌細胞中Ki-67陽性表達率均顯著低于對照組,觀察組小鼠心肌組織中Ki-67陽性表達率顯著低于正常組;此外,本研究結果表明,干擾組小鼠心肌細胞中PKN1 蛋白和mRNA相對表達量均顯著低于對照組。這表明,通過降低小鼠心肌細胞中PKN1表達,可抑制小鼠心肌細胞的增殖能力。

為了探究PKN1調控心肌細胞增殖的機制,本研究通過 Western blot檢測cyclin D1蛋白表達,結果顯示,干擾組小鼠心肌細胞中cyclin D1蛋白相對表達量顯著低于對照組;這表明,在小鼠心肌細胞中PKN1表達降低可抑制cyclin D1蛋白表達,從而抑制心肌細胞增殖,其機制可能與調控細胞周期有關。

4 結論

在小鼠心肌細胞中PKN1表達降低可抑制cyclin D1蛋白表達,從而抑制心肌細胞增殖。本研究為調控心肌細胞增殖提供了新的靶點,為心肌梗死后心功能恢復奠定基礎。未來將通過設置PKN1高表達組進一步驗證PKN1對心肌細胞增殖的調控作用及機制。