縫隙介導干細胞治療缺血性卒中的研究進展

楊艾琳 劉長興 王金仙 鄭艷 常翔

卒中發病率的增加與人口老齡化的加劇,給全世界帶來了巨大的社會和經濟負擔[1]。缺血性卒中(ischemic stroke,IS)占卒中主要類型的87%[2],目前臨床上針對卒中的血栓溶解治療與血管內機械取栓治療都受到嚴格的時間窗限制[3],且患者在治療后多遺留各種神經功能缺損癥狀[4],這對卒中幸存者后續的工作與生活造成了嚴重困擾。因此,臨床上需要探索一種有效且治療時間窗寬的治療方法。隨著干細胞研究的發展,細胞治療已經成為IS治療的新策略,間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)、神經干細胞(neural stem cells,NSCs)以及胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)通過縫隙連接(gap junction,GJ)的細胞-細胞相互作用是治療IS的關鍵機制。本文就上述類型的干細胞通過GJ介導治療IS的研究進展作一綜述,以期為該病的臨床治療提供新的思路。

1 IS

IS是由于栓子或血栓導致供血動脈閉塞,缺血、缺氧所致的局限性腦組織壞死或軟化。在IS的發病機制中,腦血管栓塞是IS發生的主要誘因,表現為暫時性的腦組織缺血,導致氧氣和營養物質輸送不足,從而引發腦組織損傷。腦血流量的減少會給卒中患者帶來一系列的不良后果,這是目前公認的觀點[5-6]。腦內持續的氧氣和葡萄糖供應是產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)和維持神經細胞跨膜梯度所必需的條件。由IS帶來的大腦中缺氧和葡萄糖缺乏,引發了一些細胞和分子反應,它的中斷導致突觸前終末的缺氧性去極化[7],擾亂了神經元和神經膠質的功能,這些事件進一步啟動了細胞死亡的級聯反應,包括細胞凋亡、壞死和自噬[8]。隨后,血腦屏障被破壞,外周炎性細胞進入腦實質[9],并通過釋放促炎細胞因子,進一步加重神經功能障礙[10]。

2 干細胞療法與縫隙連接

干細胞療法以MSCs、HSCs、NSCs和ESCs為主要細胞來源[11],可能通過分泌各種神經營養因子,如腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并代替受損神經元來實現神經保護和修復。組織再生過程中廣泛的細胞-細胞通信是通過細胞外ATP的嘌呤能信號來協調的,這種通信的ATP釋放是由連接蛋白(connexin,Cx)和其形成的半通道介導的。

GJ是由Cx的半通道組成的親水性通道,每個Cx位于相鄰細胞的膜上,這種細胞膜通道有助于相鄰細胞間小分子和小代謝物的直接交換[12]。這些通道在神經元的分化、維持、存活和功能中起著重要作用,由于其在干細胞整合、損傷和髓鞘再生中發揮作用,GJ成為神經再生醫學很有前景的治療靶點[13]。研究發現,GJ直接連接相鄰細胞的細胞質,其連接通道允許離子和代謝物等小分子在細胞內根據它們在細胞之間的濃度梯度進行雙向交換[14],其中以葡萄糖最具代表性,它們可以被移植的干細胞通過GJ轉移到細胞-細胞間進行相互作用,因此,干細胞療法的研究需要深入了解細胞-細胞間通訊在其中發揮的積極作用。

3 MSCs

3.1 細胞來源與作用機制 MSCs是一種多能的非造血細胞群體,在許多器官的組織中都有發現,比如骨髓、脂肪組織、骨骼肌組織、肺組織、心臟、臍帶血以及內皮細胞[15]。除了廣泛可及性,MSCs還可以定位到損傷部位,且具有不需要基因匹配的“免疫特權”[16],在過去20年的研究里已經證明移植MSCs是安全的[17],針對IS發生后的康復是有效的[18],這些優點使MSCs成為治療卒中理想的細胞來源。

MSCs能夠直接穿過血腦屏障(blood brain barrier,BBB)到達腦損傷部位,通過減緩細胞凋亡過程[19],促進血管生成[20],抑制炎性并進行免疫調節[21],從而達到治療IS的目的。移植MSCs可以降低卒中后神經元鈣調磷酸酶的表達,達到減緩細胞凋亡并發揮神經保護的作用[22]。研究發現,MSCs能夠避免免疫識別,分泌一系列的抗炎介質,改善和調節破壞性炎性反應,保持其免疫調節和抗氧化活性[23]。此外,移植MSCs可以刺激內源性神經發生,改善神經功能[24],這在IS發生后功能的恢復方面是十分重要的。

3.2 MSCs通過GJ治療IS MSCs是干細胞治療的主要類型之一,許多與之相關的臨床前及臨床試驗得到了認可。研究表明,GJ偶聯在細胞存活和維持干細胞自我更新狀態方面有關鍵作用,而未分化的MSCs具有良好的GJ偶聯[25]。Kikuchi-Taura等[26]通過觀察卒中小鼠GJ通道阻斷前后MSCs的作用,證明了移植的MSCs通過GJ介導可以與受體細胞(包括內皮細胞和循環中的淋巴細胞/單核細胞)之間進行直接細胞-細胞相互作用,結果顯示GJ介導的MSCs抑制了血管內皮細胞攝取VEGF以及巨噬細胞/小膠質細胞的激活,這對IS后腦內炎癥抑制是非常重要的。此外,他們還認為MSCs等同于腦血管周細胞(Pericyte,PC),起著血管內皮細胞的調節作用,在缺血/缺氧的條件下,PC可以獲得多潛能干細胞活性,并可以分化為BBB/神經血管單位的主要成分,從而促進神經修復與血管生成[27]。根據Ogawa等[28]的推測,外源性MSCs可能通過從血管內吸收多余的能量來幫助血管內皮細胞恢復正常的代謝功能,這意味著應用MSCs治療IS的最佳時間是在炎性反應活躍的急性期。

在大腦中,線粒體可從星形膠質細胞轉移到神經元,有助于IS后的神經保護恢復[29]。Lu等[30]發現在損傷脊髓移植線粒體和骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)能夠改善脊髓損傷大鼠的運動功能恢復。BM-MSCs可以通過GJ將健康的線粒體轉移到受損細胞,且間隙連接細胞間通信增強劑視黃酸增加了線粒體從BM-MSCs向神經元的轉移量,減少了細胞凋亡并促進了細胞存活,產生ATP,減輕炎性反應,最終挽救受損神經元[30]。

4 HSCs

4.1 細胞來源與作用機制 HSCs可以直接從人類臍帶血中獲取[31],除了臍帶血,HSCs已經在許多成人組織中被發現,但主要在骨髓、脾和肝臟中進行研究[32]。其中骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells,BM-MNCs)是一種豐富的造血干細胞來源,已廣泛應用于缺血性疾病的實驗治療,包括IS[33]。

HSCs負責人體內所有血細胞的生成,在過去HSCs多用于治療血液和免疫系統的惡性和非惡性疾病[34]。目前,移植HSCs已經演變成許多非血液疾病的治療手段,尤其是大腦疾病[35]。移植后的HSCs可以提供旁分泌效應,如促進細胞存活、刺激神經干細胞的增殖和遷移、誘導受損腦細胞的再生、減少炎癥以及促進血管生成[16]。此外,HSCs可以向受損的血管內皮細胞提供多種代謝產物以及氨基酸作為能量來源,有助于激活血管內皮細胞的能量代謝[28]。研究表明,在中腦動脈栓塞卒中模型中,移植HSCs有縮小其大腦皮質缺血性梗死體積的作用[36]。

4.2 HSCs通過縫隙連接治療IS HSCs和骨髓(BM)微環境之間的相互作用對維持穩態和造血再生至關重要,來自骨髓造血微環境的體液和旁分泌信號控制HSCs活性,骨髓基質細胞的細胞間信號以細胞結合或分泌因子的形式,或通過物理相互作用的方式,調節HSCs在骨髓HSCs壁龕內的定位、維持和分化[37]。有研究提出,HSCs與血管內皮細胞的相互作用是通過GJ直接細胞-細胞接觸來調節的[38]。據報道,給藥后的HSCs向受損的腦血管內皮細胞捐獻大量小分子物質,激活大腦的能量代謝,改善其功能,因此在卒中亞急性期,當炎性反應減輕后,是HSCs給藥的最佳時間[28]。

葡萄糖在HSCs和血管內皮細胞之間通過GJ構成干細胞治療的重要機制,BM-MNCs是一種富含造血干細胞的細胞組分,移植的BM-MNCs可以通過GJ的細胞-細胞相互作用激活腦內皮細胞。Kikuchi-Taura等[39]采用腦缺血模型評估移植BM-MNCs通過GJ細胞-細胞直接相互作用對缺血組織內皮細胞的影響,結果發現小鼠的BM-MNCs具有較高的葡萄糖濃度,通過GJ可以將葡萄糖等小分子從BM-MNCs轉移到內皮細胞,從而增加血管內皮細胞對VEGF的攝取,這種能量來源可以激發血管生成,抑制自噬,并支持缺血后受損內皮細胞的生存。相反,阻斷GJ可抑制VEGF的攝取。

5 NSCs

5.1 細胞來源與作用機制 NSCs大量存在于胎兒大腦中,尤其是在非常早期的發育階段。從胎兒大腦中獲取的NSCs可以在實驗室中分離并生長為單層細胞或漂浮的球體,產生神經營養因子,并分化為更明確的神經元譜系[40]。目前,利用細胞分離和細胞培養技術的進步,實現了對大量NSCs的獲取,促進了對NSCs的基礎研究[41]。

NSCs是一種多能祖細胞,負責產生神經系統中的所有神經元和大膠質細胞[42]。NSCs應用的基礎是能夠釋放神經營養因子并分化為神經和神經膠質細胞,從而促進神經發生和替代大腦的病變或損傷區域。移植NSCs可以維持BBB、減輕神經炎癥以及增加神經發生,是治療缺血性卒中的有效方法[43]。近年來,移植NSCs已經被證明可以通過神經保護以及免疫調節的方式,而不是簡單的細胞替代來促進腦損傷后的功能恢復[44]。培養的NSCs可以分泌多種營養因子,如BDNF、EGF和VEGF,從而促進血管生成[45]。此外,研究表明移植NSCs后,IS引起的炎性反應顯著減少,同時還抑制了小膠質細胞的激活[46],并且在IS后的免疫調節中下調了促炎因子和免疫細胞的活性[47]。

5.2 NSCs通過縫隙連接治療IS 基于NSCs的治療主要有兩種策略：移植外源性NSCs和促進內源性NSCs的自我修復。Jiao等[48]發現細胞間連接在調控NSCs/神經前體細胞(Neural precursor cells,NPCs)的存活、增殖和分化等方面起著重要的作用,可以通過上調GJ和神經營養因子的表達來促進NSCs/NPCs的存活、增殖和神經元分化。GJ可以維持NSCs的穩態,通過GJ偶聯移植小鼠或人NSCs功能整合到宿主神經環路,并影響宿主細胞是一種必要的方式。有研究發現,通過對外源性NSCs建立GJ,使其直接與宿主相互作用,起到了保護宿主神經元免于死亡并減少反應性星形膠質細胞增生癥等繼發性損傷的作用[49]。另外,NSCs通過早期的功能GJ,允許跨細胞傳遞動態平衡調節分子,以及通過鈣波直接影響宿主的協調活動,可能會使原本瀕臨滅絕的神經元群體受益[49]。

6 ESCs

6.1 細胞來源與作用機制 ESCs來源于胚泡階段的內細胞團,20世紀90年代末研究人員首次報道了人類胚胎干細胞(hESCs)的分離技術,極大地推動了人類神經分化的研究[50]。

ESCs是一種多能祖細胞,具有無限自我更新與在適當的條件下向體內分化所有細胞類型的能力[51]。ESCs可以先分化為NPCs,隨后再分化為神經元或神經膠質細胞[52]。神經元替代療法通常利用ESCs或誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)在體外分化的神經元,或者通過表達轉錄因子、信號分子或小分子治療對分化的成體細胞進行直接重新編程[53]。另外,ESCs來源的細胞外小泡在IS發生后可以通過免疫調節的作用,減輕缺血性腦損傷,促進神經恢復[54]。

6.2 ESCs通過縫隙連接治療IS 研究表明,功能性GJ是hESCs在不同培養條件下維持的共同特征,并且在hESCs增殖、凋亡、多能性與集落生長中發揮作用[55]。但由于ESCs的來源和使用在倫理和法律層面上存在爭議,該領域的研究方向已逐漸向著iPSCs和成體干細胞等替代干細胞方向發展。

7 研究局限性

首先,在細胞移植過程中,干細胞的類型、來源、給藥方式、給藥時間以及劑量都可能影響治療效果。大量的動物研究數據已經證明,在應用干細胞治療后,受損的神經功能得到顯著改善。因此,我們仍需要進一步的研究確定最佳的細胞類型、來源、途徑、時機和劑量,為治療常規建立詳細和有效的標準,并加強對不良事件的監測和管理。

其次,干細胞的細胞歸巢、細胞存活以及細胞追蹤難的問題仍尚未解決。移植干細胞歸巢是指從應用部位定向遷移到靶組織,其效率仍有待提高,歸巢機制有待闡明[56]。腦卒中急性發病所帶來的缺血、缺氧、營養因子缺乏、氧化應激與炎性反應,都會影響細胞的存活[57]。另外,理想的體內的細胞追蹤技術有助于研究人員更好地提高細胞存活和遷移效率,并更好地評估干細胞治療的有效性和安全性[58]。

最后,GJ允許相鄰細胞之間調節離子或小分子的細胞間交換,并且是介導直接細胞質交換的惟一通道。然而,過去干細胞通過GJ介導治療IS的研究多專注于葡萄糖這種可溶小分子。Ogawa等[28]提出,除葡萄糖外,還有許多分子極有可能通過縫隙連接進行轉移,我們在未來可以繼續探索縫隙連接傳輸分子的選擇性或優先級,找尋更多優質的分子。

8 總結與展望

干細胞在治療神經系統疾病方面顯現出極大的可塑性,可以被誘導分化為各種類型的成熟神經細胞,此外,干細胞還可以分泌各種神經營養因子促進神經修復。上述研究已經證實了MSCs、HSCs、NSCs以及ESCs在IS基礎研究和治療應用中的重要價值,通過GJ可進一步提高干細胞移植的治療效果。隨著細胞分離和細胞培養技術的進步,特別是對ESCs和iPSCs的鑒定,極大促進了干細胞治療IS的研究。一方面,GJ的細胞-細胞相互作用是缺血后損傷細胞自我更新和支持存活的重要途徑,同時也是缺血后激活內皮細胞血管生成的主要途徑。另一方面,干細胞的移植可以通過GJ釋放多種神經營養因子來刺激神經再生、神經保護和神經功能的恢復。

目前,干細胞治療仍處于實驗室和動物模型階段,但基于已報道的研究結果,干細胞治療在各種動物模型中普遍被認為是安全的,并且具有良好的耐受性。但由于人體與動物模型存在差異,未來仍需進一步針對人體的干細胞療法的安全性和有效性進行更多研究。一項成年卒中幸存者的橫截面調查顯示,僅有25%的受訪者考慮接受干細胞療法,并且他們對其安全性、有效性以及可負擔性仍抱有顧慮[59]。隨著對再生醫學的重視,有助于在未來解決干細胞移植過程中尚未解決的技術問題,同時通過普及推廣,從而增加患者及家屬考慮接受這些治療的可能性因素。干細胞通過GJ介導在治療IS的領域有益的嘗試已經取得了一定的成功,GJ的干預可能是干細胞治療IS的有前景的策略,其療效和臨床應用前景值得進一步探索,最終幫助我們治療IS。