IL-1Ra基因多態性與無癥狀細菌性陰道病自然轉歸關系的研究

張 瑞,高佳惠子,董翰宇,李 昶,尹海旭

無癥狀性細菌性陰道病(asymptomatic bacterial vaginosis,aBV)是臨床最常見的一種陰道微生態失衡狀態,其微生態學特征與細菌性陰道病相同[1-2]。研究[2]表明,aBV與多種不良結局密切相關,然而臨床治療面臨的最大困境是高復發率,缺乏獲得長久療效的策略。前期研究[1]的結果提示,應該深入研究影響aBV結局的影響因素,探索根據不同特征將aBV患者進行分組管理和干預以獲得良好臨床轉歸的可能性。白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)是免疫應答和炎癥反應過程中的關鍵物質[3]。IL-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra)能競爭性地與IL-1β受體結合,從而阻斷IL-1β的生物效應,參與局部免疫調控[4]。IL-1Ra基因第2內含子的多態性導致IL-1Ra有5個等位基因,其中等位基因A2與IL-1β的反應遲鈍有關,近而影響正常免疫反應[5]。該研究將探討等位基因A2與aBV不同結局之間的關系,為探討分組干預管理、獲得良好臨床轉歸提供基礎性信息。

1 材料與方法

1.1 病例資料aBV患者納入標準：從2016年9月至2019年1月在北京大學第一醫院體檢中心體檢人群中篩選年齡18～45歲,無自覺癥狀且陰道微生態分析Nugent評分大于6分的育齡期女性。排除標準：① 妊娠、哺乳期;② 4月內用藥者(抗生素、抗真菌藥、避孕藥等);③ 有其它疾病需要治療者;④ 婦科檢查發現陽性體征者;⑤ 依從性不好;⑥ 下列任何一項影響：衣原體、淋球菌、AV、滴蟲和假絲酵母菌。該研究獲得北京大學第一醫院倫理委員會批準,所有志愿者均自愿簽署知情同意書。

1.2 標本收集

1.2.1陰道灌洗液標本 做婦科檢查時,取膀胱截石位,打開窺器,暴露陰道,用10 ml無菌生理鹽水沖洗陰道壁中段,吸取并收集5 ml灌洗液,于4 ℃離心機6 500 r/min離心5 min,取上清液保存于冰箱(-80 ℃)備用。

1.2.2血液標本收集 患者的血樣標本均來自其體檢血液學檢測時的剩余標本。

1.3 臨床隨訪研究終點為4個月,根據癥狀及微生態學分析,將所有志愿者的結局劃分為3種：自愈、進展及無明顯改變[1]。

1.4 基因分型檢測[6]IL-1Ra基因多態性采用PCR擴增含有第2內含子基因片段的方法來分析。IL-1Ra第2內含子中有86 bp重復單元,能擴增出412、240、498、326、584 bp的片段,分別代表等位基因IL-1Ra-1(A1)、IL-1Ra-2(A2)、IL-1Ra-3(A3)、IL-1Ra-4(A4)、IL-1Ra-5(A5)。引物序列：正向5′-CTCAGCAACACTCCTAT-3′,反向5′-TCCTGGTCTGCAGGTAA-3′。采用25 μl反應體系,含有PCR Master Mix(Promega)、DNA模板、正反向引物各1 ml。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳,經0.1%溴化乙錠染色后在分析儀上檢測PCR擴增產物。

1.5 陰道分泌物中IL-1β和IL-1Ra濃度的檢測IL-1β和IL-1Ra的檢測采用ELISA試劑盒(Abcam,ab303763, ab211650)檢測,操作步驟嚴格按照說明書進行。

2 結果

2.1 標本收集情況該研究共納入1 014例aBV患者,其中984例完成該研究的所有隨訪。13例患者凍存的標本在進行IL-1Ra基因多態性、IL-1β和IL-1Ra檢測時沒有獲得數據結果。共有971例患者的檢測結果納入本研究。按照臨床轉歸,971例患者分為：自愈40例,病情進展430例,病情無明顯變化501例。見表1。

2.2 IL-1Ra基因多態性如表2所示,本研究中的971例aBV患者中,檢測到的基因型有A1/A1、A1/A2和A2/A23種,其中主流人群的基因型在各組均為A1/A1,最少見的基因型均為A2/A2,未發現少見類型的基因型女性。2個等位基因在3種結局的人群中表現頻率存在一定差異。其自愈組A2等位基因的陽性頻率最低,與進展組比較,差異有統計學意義(P<0.05),與無變化組比較,差異無統計學意義。

表2 各組IL-1Ra基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

2.3 陰道分泌物中IL-1β和IL-1Ra的含量所有標本中均能檢測到IL-1β和IL-1Ra,其中自愈組的IL-1β水平高于進展組(P<0.05),而自愈組的IL-1Ra水平低于進展組(P<0.05)。在等位基因A2攜帶時,IL-1Ra的水平較等位基因不攜帶時更高,但是差異無統計學意義(表3)。

表3 IL-1β和IL-1Ra在各組的含量

3 討論

aBV是臨床工作中非常常見的一種女性生殖系統異常狀態,其微生態學特征與細菌性陰道病一樣,但是缺乏臨床癥狀。研究[7-8]表明,aBV患者更易被人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持續感染,而高危型HPV持續感染是導致宮頸癌發生的最主要因素。aBV與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、淋球菌、衣原體和滴蟲感染明顯相關。另外,aBV能導致盆腔炎、不孕、流產、早產、胎膜早破及多種不良結局,嚴重影響母兒健康[9]。由于aBV具有隱蔽性,其巨大的危害常常被大家忽略。aBV患者無自覺癥狀,很難被發現和確診。隨著社會的發展、人民生活水平的提高,逐步推廣的健康體檢,讓越來越多的aBV患者被發現和診斷。根據課題組前期的研究[1]結果,如何將aBV患者人群按照一定的特征進行分類之后,再實施不同的管理和干預策略,可能是一個有意義的探索方向。

IL-1β是一個主要的前炎癥因子,能誘導許多細胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的合成,參與免疫反應過程[10]。IL-1Ra是個天然的IL-1β效應抑制劑,能夠通過一定的機制抑制IL-1β的反應,調控IL-1β介導的免疫反應,多數情況下,IL-1Ra抑制了IL-1β產生的過渡免疫反應,保護正常的組織結構免受免疫反應的破壞[10]。研究[3,10]表明,革蘭陰性短桿菌和陰道加德納菌能刺激IL-1β和IL-1Ra基因的表達。陰道菌群異常和細菌性陰道病時,IL-1β和IL-1Ra均會不同程度升高[11]。IL-1Ra的編碼基因第2內含子存在多態性,有5種不同重復組合等位基因(包括IL-1RaA1、IL-1RaA2、IL-1RaA3、IL-1RaA4和IL-1RaA5),各等位基因在不同人群中的分布存在差別。在中國人群中IL-1RaA1發生頻率最高,IL-1RaA2次之,其它類型及其少見[12]。不同的基因型對陰道菌群的反應、對IL-1β的調控效力可能存在差別[13]。該研究首次探討了IL-1Ra基因第2內含子多態性與aBV患者自然結局的關系。結果顯示,aBV患者中,A1/A1是主流的基因型,占據人群的68.5%～87.5%,而A2/A2基因型比例最低,僅占人群的2.5%～11.4%。其中等位基因A1的比例78.5%～92.5%,而等位基因A2的比例7.5%～21.5%。這與中國人群中基因多態性的分布特征一致[14]。最重要的是A2等位基因的比例在自愈組和病情進展組存在顯著差異,這提示A2等位基因可能是導致aBV患者出現不同結局的重要因素之一。

IL-1Ra的水平從一定程度上反應了IL-1Ra基因表達的情況。本研究顯示IL-1β和IL-1Ra水平在自愈組和進展組均存在顯著差異,這提示這兩個因子可能與aBV的結局存在相關性。在自愈組和進展組,IL-1β和IL-1Ra呈反向相關,這提示了IL-1Ra對IL-1β可能存在負性調控。而當A2等位基因存在時,IL-1LRa的水平沒有發生明顯變化時,IL-1β的水平在兩組間也有明顯差異,這提示除了IL-1Ra能夠調控IL-1β之外,可能存在其它機制也參與了IL-1β的調控。