秋水仙堿經由Hippo信號通路對小鼠肝癌的影響及其機制研究

徐燕燕,朱樂樂,李苗苗,楊 雁

肝癌(hepatocellular carcinoma , HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一,具有高發病率且難以治療的特點,是世界上第三大癌癥相關死亡原因[1]。近年來,肝癌患者大多采用腫瘤切除、射頻消融術等外科手術治療,但由于這些治療手段費用昂貴,風險高,化療毒性大,肝癌患者的預期壽命顯著縮短[2]。因此,迫切需要針對肝癌采取更多預防性、低費用的治療策略。

秋水仙堿(Colchicine)是被稱為“草地藏紅花”植物中提取的有機生物堿[3]。現有研究[4]表明,秋水仙堿對原發性肝癌有一定的抑制作用,但秋水仙堿對肝癌治療的作用機制尚不明確。據報道[5],Hippo信號通路的下游效應因子YAP和TAZ不僅與肝臟炎癥和肝纖維化有關,而且還是肝癌腫瘤微環境中不可或缺的信號樞紐。然而秋水仙堿能否通過調控Hippo信號通路影響肝癌的發生發展目前未見報道。因此,該實驗旨在探討秋水仙堿對小鼠肝癌的治療作用,并進一步研究其介導Hippo信號通路的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 30只6周齡的健康雄性C57BL/6J小鼠,體質量20～22 g,購自河南思科巴斯生物科技有限公司[證書編號：SYXK(安徽)2020-001]。小鼠飼養在具有獨立通風的IVC籠盒中(SPF屏障系統),并喂以高壓消毒飼料和水。環境恒定溫度24 ℃,相對濕度50%,噪聲小于60分貝,12 h交替光/暗循環。小鼠在上述條件下飼養1周,以適應實驗前的實驗室條件。本課題中所涉及的實驗小鼠的日常飼養及各類實驗皆嚴格遵守國家和機構關于在科學實驗中人道利用動物的公約和指南(倫理批準代碼：LLSC,20180015)。

1.1.2主要藥品與試劑 秋水仙堿 (純度≥98.0%,編號：PS0197-0025) 購自成都Push生物技術公司;兔抗MST1 (#3682)、pYAP (Ser127) (#13008S)、YAP(#14074)、pTAZ(#59971)、TAZ(#72804) 抗體購自美國 Affinity Biosciences公司;四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)(編號：C805332;純度≥98.0%,相對分子質量：153.82) 購自江蘇欣諾科催化劑股份有限公司;二乙基亞硝胺 (diethylnitrosamine, DEN)(編號：73861;純度≥99.0%,分子量：102.14) 購自焦作沃恩生物科技有限公司。乙醇(ethanol,C2H5OH)(編號：100092008;純度≥99.7%,相對分子質量：46.07)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

1.1.3主要儀器 高速冷凍離心機購自張家港市騰鷹機械制造有限公司;病理組織包埋機購自德國 Leica 公司;冷凍研磨儀購自上海凈信公司;PCR儀購自廣州市華粵行儀器有限公司;YJ-1450型醫用凈化工作臺購自蘇州菲泰克環境技術有限公司;水平電泳儀購自德諾杰億生物科技有限公司(北京);熒光顯微鏡購自基恩士有限公司(上海)。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組及處理 選30只體重相近的健康雄性小鼠,隨機均分為3組：對照組、模型組、秋水仙堿組,建立DEN/CCl4/C2H5OH誘導小鼠肝癌模型及秋水仙堿干預。模型組和秋水仙堿組按照以下方式進行造模：① 1 ～2周,腹腔注射1.0% DEN,每周1次;② 3～7周,灌胃20 % 溶于橄欖油的CCl4溶液(5 ml/kg),每周2次;③ 8～18周,灌胃20 % 溶于橄欖油的CCl4溶液(6 ml/kg),每周2次; ④ 第3周開始,將含有10%的乙醇溶液作為飲用水,置于鼠籠,任小鼠自行飲用;⑤ 第19周開始,停止所有化學試劑,常規飲食飲水至第20周末。同時,秋水仙堿組按體重0.1 mg/kg每天給小鼠灌胃秋水仙堿。對照組給予相應的溶媒,常規飲食飲水。20周末,用異氟烷對小鼠進行麻醉后,摘除眼球取得血清,置于沾有1%肝素鈉溶液EP管中,用試劑盒檢測轉氨酶水平。頸椎脫臼處死小鼠,取小鼠肝臟,注意其完整性,用PBS溶液清洗黏附的血液,在明亮的環境下觀察小鼠肝臟的大體形態并拍攝照片。用濾紙擦干肝臟表面,取部分小鼠肝小葉在4%多聚甲醛中固定,進行石蠟切片。其余部分凍存于-80 ℃,用于后期肝組織指標測定、免疫熒光和Western blot實驗。

1.2.2小鼠肝臟指數的測定 實驗開始前對小鼠進行稱重并記錄,解剖取出小鼠肝臟稱重并記錄,根據公式計算,肝指數=肝重/體質量×100%。

1.2.3小鼠血清中谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測

1.2.3.1血清的分離處理 將采集的小鼠血液于冰上靜置2 h,提前將高速冷凍離心機預冷至4 ℃,將裝有小鼠血液的EP管對齊放置于4 ℃冷凍離心機中3 500 r/min離心15 min,吸取上清液于新的EP管內,4 ℃保存備用。

1.2.3.2血清生物標志物測定 按照試劑盒說明書指示,檢測小鼠血清中AST和ALT水平,并通過酶標儀獲得血清中各指標的吸光度(absorbance,A)值,計算各樣本中AST和ALT的具體值。

1.2.4蘇木精-伊紅(HE)染色法 取出多聚甲醛中固定的肝組織,進行組織標本固定并包埋在石蠟中,用切片機切成3～5 μm的切片。組織切片依次在不同濃度的二甲苯和無水乙醇中浸泡相應的時間進行脫蠟和水化,蘇木精中染色,流水中洗滌以顯出藍色,然后伊紅染色后置于蓋玻片下封片。光學顯微鏡下對腫瘤和肝組織進行組織病理學檢查。

1.2.5免疫熒光 在封閉前用檸檬酸鹽修復液對組織切片進行抗原修復。切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,然后與羅丹明綴合的山羊抗兔IgG在37 ℃下孵育50 min。用 PBS 洗滌后,滴加適量DAPI溶液于室溫孵育10 min。切片用PBS沖洗并用抗熒光淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察和拍照,通過ImageJ軟件對陽性信號進行量化。

1.2.6Western blot 從肝組織中提取總蛋白,用BCA試劑盒定量樣品中的蛋白濃度,將樣品變性并通過10%或15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。用5% 脫脂牛奶封閉 1 h 后,一抗在4 ℃下孵育過夜,用 Tris-HCl 緩沖鹽溶液(TBST)洗脫 3 次,然后與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG在室溫下孵育1 h。用TBST洗脫后,用增加型化學發光試劑覆蓋PVDF膜,并使用Gel Pro分析軟件檢測不同的目標蛋白,對蛋白質條帶強度進行半定量分析。

2 結果

2.1 秋水仙堿對DEN/CCl4/C2H5OH誘導的肝癌期小鼠肝組織病理學改變的影響肝活檢和組織病理學檢查結果顯示,對照組小鼠肝臟邊緣清晰,顏色紅潤,有光澤,表面無斑點、結節,而模型組小鼠肝臟表面粗糙,無光澤,邊緣有皺紋,切面有明顯的米黃色顆粒狀增生結節,質地較硬,相比于模型組,秋水仙堿組小鼠肝臟表面略為光滑且邊緣無褶皺,顆粒狀結節斑塊數量也減少,見圖1 A。HE染色結果顯示,對照組小鼠肝小葉結構完整,肝細胞排列整齊,大小均勻,無明顯壞死或核碎裂區,模型組肝臟損害,有可見斑點、碎片壞死,肝小葉廣泛堆積,可見明顯的膠原纖維,肝細胞排列紊亂,肝竇體積變大,肝細胞大小也發生改變。與模型組比較,秋水仙堿組炎癥細胞浸潤減輕,膠原束數量明顯減少,肝細胞排列趨于規則,見圖1 B。如表1所示,模型組小鼠腫瘤發生率為100%,腫瘤結節直徑均大于1 mm,但秋水仙堿處理后小鼠腫瘤發生率降低(P<0.01),說明秋水仙堿降低肝癌結節的發生率和多樣性。上述結果提示,秋水仙堿組小鼠肝組織病變程度減輕,表明秋水仙堿具有一定抗肝癌作用。

表1 秋水仙堿對誘導的小鼠肝組織腫瘤的影響(n=8)

圖1 秋水仙堿對肝癌小鼠肝組織病理學的影響

2.2 秋水仙堿對DEN/CCl4/C2H5OH誘導的肝癌期小鼠體質量與肝臟指數的影響與對照組相比,模型組小鼠的肝重、體質量都有所減少(P<0.05,P<0.01),體質量尤甚;與模型組相比,秋水仙堿組小鼠的肝重、體質量均增加 (F=7.637,P<0.05;F=190.3,P<0.01),見圖2 A、B。小鼠肝臟指數結果顯示,模型組的肝臟指數高于對照組(F=105,P<0.01),秋水仙堿組與模型組相比差異無統計學意義,見表2、圖2 C。提示DEN/CCl4/C2H5OH 造模對小鼠的肝臟造成一定的損傷,秋水仙堿對小鼠肝臟有保護作用。

表2 秋水仙堿對小鼠肝臟指數及血清ALT和AST的影響

圖2 秋水仙堿對肝癌小鼠肝指數的影響

2.3 秋水仙堿改善DEN/CCl4/C2H5OH誘導的肝癌期小鼠肝功能在肝功能檢查中,ALT和AST是反映肝細胞受損的指標。與對照組相比,模型組小鼠的ALT和AST水平顯著升高(均P<0.01);與模型組相比,秋水仙堿組小鼠給藥后ALT和AST水平有所降低(FALT=136.1,FAST=143.7,均P<0.01),見表2、圖3 。提示DEN/CCl4/C2H5OH導致小鼠肝臟發生病變,肝功能受損,秋水仙堿能夠降低小鼠肝臟的病變程度,改善小鼠肝功能。

圖3 秋水仙堿對肝癌小鼠ALT(A)與AST(B)的影響

2.4 秋水仙堿對DEN/CCl4/C2H5OH誘導的肝癌期小鼠肝組織中Hippo通路相關蛋白MST1表達的影響免疫熒光結果分析顯示,對照組小鼠肝組織中MST1蛋白表達較少,與對照組相比,模型組小鼠肝組織中MST1蛋白表達增多(P<0.01),與模型組相比,秋水仙堿治療組小鼠肝組織中MST1蛋白表達進一步增強(F=140.7,P<0.01)。提示秋水仙堿能夠促進小鼠肝組織中MST1蛋白的表達,見圖4。

圖4 秋水仙堿對肝癌小鼠肝組織中MST1蛋白表達的影響 免疫熒光染色 ×40

2.5 秋水仙堿對DEN/CCl4/C2H5OH誘導的肝癌期小鼠肝組織中YAP、pYAP蛋白表達的影響免疫熒光結果分析顯示,與對照組相比,模型組小鼠肝組織中YAP蛋白表達明顯增加(P<0.01),pYAP蛋白表達明顯減少(P<0.01);與模型組相比,秋水仙堿組小鼠肝組織中YAP蛋白表達減少,pYAP蛋白表達增加(FYAP=81.44,FpYAP=85.34,均P<0.01)。提示秋水仙堿能夠促進小鼠肝組織中pYAP蛋白的表達,降低小鼠肝組織中YAP蛋白的表達,見圖5。

圖5 秋水仙堿對肝癌小鼠肝組織中YAP(A)、pYAP(B)蛋白表達的影響 免疫熒光染色 ×40

2.6 秋水仙堿對DEN/CCl4/C2H5OH誘導的肝癌期小鼠肝組織中TAZ、pTAZ蛋白表達的影響免疫熒光結果分析顯示,與對照組相比,模型組小鼠肝組織中TAZ蛋白表達明顯增加(P<0.01),pTAZ蛋白表達明顯減少(P<0.01);與模型組相比,秋水仙堿治療組小鼠肝組織中TAZ蛋白表達減少,pTAZ蛋白表達增加(FTAZ=99.10,FpTAZ=68.14,均P<0.01)。提示秋水仙堿能夠促進小鼠肝組織中pTAZ蛋白的表達,降低小鼠肝組織中TAZ蛋白的表達,見圖6。

圖6 秋水仙堿對肝癌小鼠肝組織中TAZ(A)、pTAZ(B)蛋白表達的影響 免疫熒光染色 ×40

2.7 秋水仙堿對DEN/CCl4/C2H5OH誘導的肝癌期小鼠肝組織中Hippo通路相關蛋白表達的影響Western blot 結果檢測顯示,與對照組相比,模型組肝組織中MST1、YAP、TAZ的蛋白表達水平升高(P<0.05,P<0.01,P<0.01),pYAP、pTAZ蛋白表達水平降低(均P<0.01);與模型組比較,秋水仙堿組肝組織中MST1、pYAP、pTAZ蛋白表達水平升高(FMST1=93.44,P<0.01;FpYAP=35.83,P<0.05;FpTAZ=41.03,P<0.05),YAP、TAZ的蛋白表達水平降低(FYAP=21.30,P<0.01;FTAZ=14.15,P<0.05)。提示秋水仙堿在治療肝癌的過程中,升高MST1、pYAP、pTAZ蛋白表達水平,降低YAP、TAZ的蛋白表達,見圖7。

圖7 秋水仙堿對肝癌小鼠肝組織中Hippo通路相關蛋白表達的影響

3 討論

在肝癌的實驗研究中,化學藥物誘發肝癌動物模型較常用,多以DEN化學藥物作為誘導劑,DEN對肝臟有特定毒性,使肝細胞大面積壞死,最終誘導肝癌的發生[6]。除了DEN外,CCl4也常作為肝癌誘導劑,CCl4是一種眾所周知的肝毒素,會導致化學性肝損傷,包括炎癥和纖維化。它在活性化合物或其代謝物的毒性中起著特殊的作用,一旦被激活,CCl4就會影響細胞穩態和后續類型的毒性。這種毒性通過改變血漿、線粒體和溶酶體膜的通透性直接損害肝細胞[7]。乙醇可以促進CCl4的吸收,加劇中毒癥狀。本實驗采用的是DEN/CCl4/C2H5OH聯合誘導法建立穩定的小鼠肝癌模型,該法建立的小鼠肝癌模型具有癌變率高、與人類肝癌的發生發展過程類似、無肝轉移的優點[8]。隨著造模的進行,小鼠出現活動減少、食欲不振、萎靡的表現,20周末,小鼠肝臟重量和體質量均降低,肝臟大體可見顏色明顯暗淡且表面粗糙,出現米白色腫瘤病灶,HE可見大量炎性細胞浸潤,以及大小不一的異型細胞核,病理上已具備肝癌的基本特征。以上實驗結果表明,DEN/CCl4/C2H5OH 能夠成功誘導小鼠肝癌模型。

其他生物堿,如紫杉醇和長春新堿,它們的結構復雜、合成難度大、生物利用度差且有毒副作用,尤其在臨床上存在多重耐藥性問題,相比之下,秋水仙堿是一種中性親脂性生物堿,且結合位點空腔體積較小,其相應抑制劑的結構較為簡單[9],它通過阻斷微管蛋白的聚合,從而影響微管的功能,集中在白細胞,尤其是粒細胞中并干擾其功能,減輕炎性反應,被用于治療和預防自身炎癥性疾病的發作[10]。同時,它也具有抗腫瘤作用,對乳腺癌療效顯著,對肺癌、胃癌、宮頸癌可能也有一定療效,它的抗癌作用的主要機制是誘導細胞毒作用,而不是通過抑制血管生成。研究[4]報道,秋水仙堿濃度為0.01 mg/ml時對肝癌有抑制作用。因此,本次實驗使用0.01 mg/ml 的秋水仙堿來治療DEN/CCl4/C2H5OH誘導的小鼠肝癌期,與模型組相比,秋水仙堿治療后炎性細胞浸潤得到明顯改善,小鼠腫瘤的發生率和多樣性降低,小鼠的體質量、肝臟重量有所增加,肝細胞壞死、細胞異型性均輕于模型組。表明秋水仙堿對DEN/CCl4/C2H5OH誘導小鼠肝癌有治療作用。

本實驗研究表明,秋水仙堿發揮抗肝癌作用可能與Hippo 信號通路有關。Hippo 信號通路啟動后,MST1被磷酸化作用而激活LATS1/2,LATS1/2激活后可磷酸化并抑制YAP/TAZ的活性[11]。其過程是磷酸化的YAP/TAZ與支架蛋白14-3-3結合,在細胞質積聚,隨后被β-TrCP E3泛素連接酶介導的泛素化和蛋白酶體降解,最終導致YAP 和TAZ促生長和抗凋亡的功能喪失[12]。本實驗結果表明,對照組小鼠MST1、YAP、TAZ的蛋白表達均較少,pYAP和pTAZ 的蛋白表達較多。相比于對照組,模型組小鼠 MST1、YAP、TAZ的蛋白表達明顯增多,pYAP和pTAZ 的蛋白表達明顯減少;秋水仙堿干預后,MST1、pYAP和pTAZ 的蛋白表達顯著增加,YAP、TAZ的蛋白表達明顯抑制。因此,秋水仙堿可能上調MST1激酶活性,增強YAP和TAZ磷酸化的分子機制,減少YAP和TAZ進入核轉錄,從而發揮抗肝癌作用。

綜上所述,DEN/CCl4/C2H5OH 誘導的小鼠肝癌中,秋水仙堿可能通過增強Hippo信號通路的上游抑癌因子MST1的表達而抑制下游基因YAP/TAZ的表達,從而發揮其抗肝癌的治療作用。