PCR 系列技術(shù)在中藥種屬及品質(zhì)鑒定中的應(yīng)用

王 卿，周新宇

（江蘇省無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 無錫 214000）

中藥是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，它們通常由復(fù)雜的天然植物和動(dòng)物組成，具有多樣的化學(xué)成分。傳統(tǒng)的中藥鑒定方法主要基于形態(tài)學(xué)﹑化學(xué)成分分析和藥效評估等傳統(tǒng)方法，但這些方法存在著一定的局限性。近年來，PCR 技術(shù)的廣泛應(yīng)用為中藥鑒定提供了新的機(jī)會(huì)。PCR技術(shù)可以通過放大目標(biāo)DNA 序列來檢測中藥樣品，并且具有高靈敏度﹑高特異性和高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。

1 PCR 技術(shù)原理

PCR 技術(shù)是一種體外DNA 擴(kuò)增技術(shù)，它包括三個(gè)關(guān)鍵步驟：變性﹑引物結(jié)合和延伸。PCR 技術(shù)利用DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性，反復(fù)進(jìn)行高溫變性﹑引物退火和延伸反應(yīng)，從而在無須細(xì)胞和基因庫的條件下，快速產(chǎn)生大量目標(biāo)DNA 序列[1]。

1.1 PCR-RFLP 技術(shù)

PCR-RFLP（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性）技術(shù)是一種用于分子鑒定和檢測樣品中摻雜成分的方法，它結(jié)合了PCR 技術(shù)和限制性內(nèi)切酶酶切分析，可以實(shí)現(xiàn)對樣品的半定量檢測。

有研究指出[2]，在PCR 反應(yīng)中使用這些DNA 模板進(jìn)行擴(kuò)增，并選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進(jìn)行酶切，由于川貝母和偽品具有不同的DNA 序列，限制性內(nèi)切酶在兩者中會(huì)產(chǎn)生不同長度的DNA 片段。這些片段通過凝膠電泳進(jìn)行分離和可視化。最后，研究人員使用專業(yè)的軟件來分析凝膠電泳圖像上的條帶強(qiáng)度，通過比較川貝母樣品與不同摻偽比例樣品的條帶強(qiáng)度，來計(jì)算摻偽量的大致比例。這種方法直觀地提供了摻假﹑摻偽樣品的半定量結(jié)果[3]。

1.2 PCR 常常結(jié)合其他技術(shù)

有研究指出[4]，在實(shí)際應(yīng)用中，PCR 常常結(jié)合其他技術(shù)進(jìn)行綜合分析，以提高鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。除了基本的PCR 技術(shù)，還有一些快速﹑小樣本﹑高通量的技術(shù)在中藥種屬及品質(zhì)鑒定中得到廣泛發(fā)展和應(yīng)用，包括基因芯片﹑一代測序（結(jié)合有中藥指紋技術(shù)）和新一代測序（NGS）技術(shù)。

還有研究指出[5]，基因芯片技術(shù)是一種高通量的DNA 分析方法，可以同時(shí)對上千個(gè)DNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。通過使用特定的DNA 探針，基因芯片可以檢測中藥材中大量的基因信息，從而實(shí)現(xiàn)種屬的鑒定和品質(zhì)分析。

一代測序技術(shù)結(jié)合了中藥指紋技術(shù)，可以對中藥材中的多個(gè)成分進(jìn)行快速﹑高效的檢測。與傳統(tǒng)的色譜分析相比，一代測序技術(shù)具有更高的靈敏度和分辨率，能夠更全面地評估中藥材的品質(zhì)[6]。

NGS 技術(shù)是一種高通量測序技術(shù)，可以同時(shí)對大量的DNA 序列進(jìn)行測序。在中藥種屬及品質(zhì)鑒定中，NGS 技術(shù)可以通過擴(kuò)增和測序中藥材中的DNA 條形碼或指紋圖譜，從而實(shí)現(xiàn)對中藥材種屬的準(zhǔn)確定量分析[7]。

綜上所述，除了基本的PCR 技術(shù)之外，結(jié)合基因芯片﹑一代測序和NGS 等高通量技術(shù)，可以更全面﹑快速地進(jìn)行中藥種屬及品質(zhì)鑒定。這些技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用將有助于提高中藥材的品質(zhì)控制和質(zhì)量評估。

2 PCR 技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用案例

2.1 DNA 條形碼技術(shù)

DNA 條形碼技術(shù)是一種基于PCR 技術(shù)的分子鑒定方法，通過特定引物擴(kuò)增中藥材DNA，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和比對，以識別中藥材的物種來源。

研究顯示[8]，對于常用的中藥材川芎，由于其形態(tài)特征與其他相似植物相近，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法存在一定的局限性。因此，研究者利用DNA 條形碼技術(shù)來準(zhǔn)確鑒定川芎。選擇合適的DNA 條形碼區(qū)域作為PCR引物，這通常是一段高度保守的DNA 片段。然后，從川芎樣品中提取總DNA，利用PCR 技術(shù)將目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增出來。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行測序，得到DNA 序列。將得到的DNA 序列與已知物種的DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，通過比對結(jié)果可以確定川芎的物種來源。如果比對結(jié)果與某一物種完全匹配，即可確認(rèn)川芎為該物種。

因此，通過DNA 條形碼技術(shù)，可以在分子水平上對中藥材進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，避免了傳統(tǒng)鑒定方法的主觀性和不確定性。此外，DNA 條形碼技術(shù)還可以應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量控制﹑真?zhèn)舞b別以及市場監(jiān)管等方面。

2.2 種質(zhì)資源保護(hù)

種質(zhì)資源保護(hù)是一種重要的措施，旨在保護(hù)和維持中藥材的遺傳多樣性，以確保其可持續(xù)利用。PCR 技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用案例之一就是通過對中藥材的遺傳多樣性進(jìn)行PCR 分析，評估并保護(hù)中藥材的種質(zhì)資源，并為中藥的合理開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

研究指出[9]，通過PCR 技術(shù)，可以利用特定的引物擴(kuò)增中藥材的DNA 樣品，并通過分析擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性來評估中藥材的遺傳多樣性。例如，研究者可以選擇適當(dāng)?shù)奈⑿l(wèi)星標(biāo)記或SNP 標(biāo)記作為PCR 引物，對中藥材不同個(gè)體或不同地理種群的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。

相關(guān)研究表明[10]，PCR 可以通過特異性引物擴(kuò)增中藥材基因組中與種屬相關(guān)的DNA 區(qū)域，從而確定中藥材的種屬。例如，在種植中藥材中，可以使用基于PCR的DNA 條形碼技術(shù)，如ITS（Internal Transcribed Spacer）序列和rbcL（Rubisco Large Subunit）等，進(jìn)行種屬鑒定。

PCR 可以用于檢測中藥材遺傳變異，評估中藥材的遺傳多樣性和品質(zhì)穩(wěn)定性。通過比較不同采集地﹑不同品種或不同批次的遺傳差異，可以對中藥材質(zhì)量進(jìn)行評估。

PCR 可以用于鑒定中藥材的真實(shí)性和純度。通過檢測特定基因或DNA 區(qū)域，可以判斷中藥材是否含有其他植物成分或摻雜物，從而確保中藥材的質(zhì)量和安全性。

PCR 可以結(jié)合其他分析方法，如定量PCR﹑實(shí)時(shí)熒光PCR 和基因表達(dá)分析等，用于評估中藥材中活性成分的含量和表達(dá)水平。這有助于控制中藥材的品質(zhì)，并為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，PCR 技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用之一是通過對中藥材的遺傳多樣性進(jìn)行PCR 分析，評估并保護(hù)中藥材種質(zhì)資源，為中藥的合理開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

2.3 中藥真?zhèn)舞b定

中藥真?zhèn)舞b定是保證中藥材質(zhì)量和安全的重要環(huán)節(jié)。PCR 技術(shù)在其中也扮演著關(guān)鍵的角色，通過擴(kuò)增和分析目標(biāo)基因，可以準(zhǔn)確地鑒定中藥材真?zhèn)危⒆R別摻假品種。

一些研究指出[11-12]，中藥真?zhèn)舞b定利用PCR 技術(shù)對中藥材中的特定基因進(jìn)行擴(kuò)增和分析。這些基因通常與中藥材的特征性成分﹑藥效或生物學(xué)特性相關(guān)。確定用于真?zhèn)舞b定的目標(biāo)基因，該基因應(yīng)具有以下特點(diǎn)：與中藥材的真實(shí)性密切相關(guān)﹑在核酸水平上穩(wěn)定存在﹑易于擴(kuò)增和分析等。從待鑒定的中藥材樣品中提取總DNA，并使用PCR 技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)基因。PCR 擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，需要確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他相關(guān)技術(shù)，對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測。通過比對待鑒定樣品的PCR 產(chǎn)物與已知真品和假品的PCR 產(chǎn)物，可以確定中藥材的真實(shí)性。還可以采用其他分析方法，如DNA 測序﹑限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析﹑單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析等來進(jìn)一步確認(rèn)中藥材的真?zhèn)巍Ｍㄟ^PCR 技術(shù)進(jìn)行中藥真?zhèn)舞b定具有高度的準(zhǔn)確性和靈敏性。它可以有效地檢測摻假品種，避免因摻雜其他植物材料或低質(zhì)量替代品而導(dǎo)致中藥材的質(zhì)量下降或藥效減弱。通過PCR 技術(shù)對目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增和分析，可以準(zhǔn)確地鑒定中藥材的真?zhèn)?，并識別摻假品種，從而保障中藥材的質(zhì)量和安全。

3 PCR 技術(shù)在中藥鑒定中應(yīng)用的挑戰(zhàn)和未來發(fā)展方向

在中藥鑒定中，PCR 技術(shù)雖然具有許多優(yōu)勢，但也面臨一些挑戰(zhàn)。其中一個(gè)重要的挑戰(zhàn)是制定和建立統(tǒng)一的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，以確保PCR 技術(shù)在中藥鑒定中的可靠性和準(zhǔn)確性。

制定和建立統(tǒng)一的PCR 檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)是關(guān)鍵。這包括選擇適當(dāng)?shù)囊锖吞结?，確定合適的PCR 條件和參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)化擴(kuò)增產(chǎn)物的分離和檢測方法等。通過建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化流程，可以提高PCR 結(jié)果的可重復(fù)性和可比性。選擇合適的引物和探針對于PCR 的成功至關(guān)重要。針對中藥材的鑒定，需要設(shè)計(jì)特異性高﹑能夠擴(kuò)增目標(biāo)基因的引物和探針。此外，還可以利用基因組學(xué)數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)工具來輔助引物和探針的設(shè)計(jì)，提高其特異性和靈敏度。

中藥材樣品通常經(jīng)過炮制﹑干燥等處理，其中可能存在DNA 的降解或污染。因此，有效的樣品預(yù)處理方法對于PCR 鑒定的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。開發(fā)適合中藥材樣品的DNA 提取和純化方法，可以最大限度地提高PCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性。建立中藥材的DNA 序列數(shù)據(jù)庫和參考標(biāo)本庫可以為PCR 鑒定提供參考。這些數(shù)據(jù)庫可以包含已知的中藥材的DNA 序列信息，以及其他相關(guān)信息，如產(chǎn)地﹑鑒定方法等。通過與這些數(shù)據(jù)庫比對，可以更準(zhǔn)確地確定待鑒定樣品的真實(shí)性。除了傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)外，還可以結(jié)合其他分子生物學(xué)技術(shù)和高通量測序技術(shù)，進(jìn)行更全面和深入的中藥鑒定。例如，利用單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析﹑基因組學(xué)﹑轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，可以進(jìn)行中藥材遺傳多樣性分析，從而更準(zhǔn)確地識別和鑒定中藥材的真?zhèn)巍?/p>

綜上所述，應(yīng)對PCR 技術(shù)在中藥鑒定中應(yīng)用的挑戰(zhàn)需要制定和建立統(tǒng)一的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步改進(jìn)引物和探針設(shè)計(jì)，優(yōu)化樣品預(yù)處理方法，建立數(shù)據(jù)庫和參考標(biāo)本庫，以及結(jié)合其他新技術(shù)的應(yīng)用。PCR 及其相關(guān)技術(shù)在中藥種屬鑒定方面具有很高的特異性和準(zhǔn)確性，可以快速且可靠地確定藥材的種屬。然而，在藥效鑒定以及原產(chǎn)地鑒定方面，PCR 技術(shù)的應(yīng)用確實(shí)存在一些限制。藥效鑒定是評估中藥材藥理作用和療效的一個(gè)重要方面。傳統(tǒng)的藥效鑒定往往需要綜合考慮多個(gè)因素，如中藥材中的多個(gè)活性成分的含量﹑它們之間的相互作用等。雖然PCR 技術(shù)可以用于對中藥活性成分相關(guān)基因的檢測和表達(dá)研究，但藥效鑒定通常需要更加復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)分析手段來進(jìn)行準(zhǔn)確評估。至于原產(chǎn)地鑒定，目前的技術(shù)并不能完全滿足要求。雖然PCR 技術(shù)可以在一定程度上幫助確定中藥材的種屬，但對于精確的原產(chǎn)地鑒定來說，還需要結(jié)合其他輔助手段，如同位素分析﹑化學(xué)成分分析等。這些方法可以從不同的角度揭示中藥材的產(chǎn)地信息，提供更全面準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

盡管PCR 及其相關(guān)技術(shù)在中藥種屬鑒定方面具有優(yōu)勢，但在藥效鑒定和原產(chǎn)地鑒定方面仍存在一定的局限性。為了得到更全面﹑準(zhǔn)確的結(jié)果，需要結(jié)合其他技術(shù)手段進(jìn)行綜合分析，并不斷推進(jìn)相關(guān)研究和方法的發(fā)展。

4 結(jié)論

PCR 技術(shù)在中藥鑒定中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過使用PCR 技術(shù)，可以快速﹑準(zhǔn)確地鑒定中藥樣品，并保護(hù)中藥的品質(zhì)和安全性。然而，PCR 技術(shù)在中藥鑒定中應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn)和限制，需要繼續(xù)改進(jìn)和發(fā)展。未來的研究方向包括標(biāo)準(zhǔn)化PCR 檢測方法﹑結(jié)合新興基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用以及建立大規(guī)模中藥數(shù)據(jù)庫等。這些努力將有助于推動(dòng)中藥鑒定領(lǐng)域的發(fā)展，并為中藥的研究和開發(fā)提供更多的支持。