基于NOD2介導的AMPK/mTOR信號通路探討宮頸癌細胞惡性行為的機制

杜瑞亭,伍東月,郭清民,靳冬梅

宮頸癌(cervical cancer,CC)是女性癌癥相關死亡的主要原因,每年估計有530 000例新病例和270 000例死亡[1]。由于轉移和復發,CC患者預后不良,生存率低[2]。因此,尋找CC的分子標志物進行早期診斷和靶向治療對于提高生存率至關重要。模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)是檢測病原體特異性分子的宿主傳感器,是抵御感染的第一道防線[3]。核苷酸結合寡聚化結構域受體2(nucleotide-binding oligomerization domain receptor 2,NOD2)是細胞上/細胞中表達的主要PRRs,能識別入侵的病原體并介導致癌作用[4-5]。研究[6]證實NOD2上調通過正調節人類鱗狀宮頸癌的致瘤性和轉移促進癌癥進展。然而,NOD2在CC中的功能在很大程度上是未知的。自噬是一種溶酶體依賴的分解代謝途徑,通過該途徑清除受損或衰老的細胞器[7]。證據[7]表明,自噬可以增強化療期間癌細胞的獲得性耐藥性。NOD2作為自噬的誘導因子[8],是否介導CC的病理機制仍不清楚。該研究探討了NOD2對CC細胞生物行為和相關信號通路及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 基因表達譜交互式分析(GEPIA)在線數據庫分析對GEPIA在線數據庫(http：//gepia.cancer-pku.cn/)的CC組織中NOD2的相對mRNA水平進行分析,包括306例CC患者和13例非癌患者。對NOD2的mRNA表達水平進行Log2轉換,將CESC患者分為NOD2高表達和低表達兩組,建立總體生存期的Kaplan-Meier生存曲線分析。

1.2 細胞系與培養人CC細胞(HeLa、SiHa、CaSki和ME-180)和人宮頸上皮細胞系Ect1/E6E7來自中國科學院細胞庫。Ect1/E6E7細胞在補充有10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養基(美國Gibco公司)中培養,HeLa、SiHa、CaSki和ME-180細胞在RPMI 1640培養基(美國Gibco公司)中培養。

1.3 細胞轉染由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成了靶向NOD2(shNOD2)和shRNAs陰性對照(shNC)。細胞培養至30%～50%匯合,用siLentFect脂質試劑(美國Bio-Rad公司)轉染shRNAs。將NOD2的全長序列克隆到pcDNA3.1載體(美國Invitrogen公司)中,構建NOD2過表達(簡稱為：NOD2)質粒,同時將空載體用作陰性對照(Vec)。當細胞達到大約90%匯合時,用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)轉染質粒。48 h后收獲轉染的細胞用于隨后的實驗。

1.4 CCK-8增殖試驗用CCK-8法(美國APExBIO公司)測定CC細胞的增殖能力。將對數生長期的細胞以1 000個/孔接種到96孔板中,并將10 μl細胞CCK-8溶液添加到每個孔中,然后在37 ℃下孵育2 h。用分光光度計計算450 nm波長處的吸光度,共3次。

1.5 集落形成試驗收集CC細胞,將1×103個細胞接種到6孔板中,并在37 ℃下孵育10 d。去除培養基后,用甲醇固定細胞,并用0.1%結晶紫染色。然后計數并記錄集落數。

1.6 細胞遷移和侵襲分析使用Transwell測定評估細胞遷移和侵襲。將轉染后的HeLa、SiHa細胞重懸于不含FBS的培養基中并調整細胞密度至2×105個/200 μl。然后,將100 μl細胞懸浮液加入Matrigel基質膠包被或未包被的Transwell上室(美國BD Biosciences公司)中,并將含有10%血清的500 μl培養基加入到下室中。在37 ℃孵育48 h后,Transwell小室用PBS洗滌3次,細胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min,然后用結晶紫染色30 min,用棉簽輕輕去除室上表面的基質膠和細胞。在顯微鏡下計數滲入Transwell室膜的腫瘤細胞數。

1.7 5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)分析將HeLa細胞或SiHa細胞接種到6孔板中,培養24 h。加入EdU溶液(瑞士Roche公司),將細胞培養2 h。用多聚甲醛固定細胞30 min,加入甘氨酸溶液5 min。加入DAPI對細胞核進行染色。將細胞固定并在熒光顯微鏡下拍照。

1.8 Western blot試驗用冷PBS洗滌細胞,然后在冰上用裂解緩沖液孵育30 min,將細胞刮下并收獲。離心后,收集含有裂解物的上清液并于-80 ℃下儲存。通過BCA檢測試劑盒(美國Bio-Rad公司)測定蛋白質濃度。將蛋白質樣品變性,隨后通過SDS-PAGE分離,并轉移到PVDF膜(瑞士Roche Life Sciences公司)上。在脫脂牛奶中孵育1 h后,使用以下一抗(美國Cell Signaling Technology公司)在4 ℃下處理膜過夜：NOD2、AMPK、p-AMPK(Thr172)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)、LC3、p62和GAPDH(均1 ∶1 000)。洗滌3次后,將膜與山羊抗小鼠或抗兔HRP偶聯二抗(1 ∶2 000,美國Cell Signaling Technology公司)一起孵育。通過ECL檢測試劑盒(美國Pierce Biotechnology公司)檢測信號。

1.9 RNA測序(RNA sequence,RNA-Seq)由上海其明信息技術有限公司進行RNA-Seq分析。提取來自用shNC和shNOD2轉染的HeLa細胞的總RNA(n=3)。將高質量的RNA樣品轉化成cDNA文庫。純化后的產物經過12～15輪的PCR擴增,形成最終的cDNA文庫。然后按照制造商的方案在Illumina Hiseq X Ten上對文庫進行測序。倍數變化>1.5和P<0.05代表差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)。

1.10 GFP-mRFP-LC3檢測自噬體使用GFP-mRFP-LC3慢病毒[和元生物技術(上海)股份有限公司]評估自噬體。然后在LSM710共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)下觀察自噬體的定位和定量。自噬體被標記為紅色和綠色(黃色熒光),而自噬溶酶體被標記為紅色。

1.11 動物實驗24只雌性BALB/c裸鼠(6～8周齡,18～20 g)由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,并在無特定病原體條件下飼養。將小鼠隨機分為4組,每組6只：載體組(Vec組)、NOD2過表達組(NOD2組)、shNC組和shNOD2組。Vec組和NOD2組小鼠尾靜脈注射轉染Vec或NOD2的SiHa細胞(1×106個細胞),shNC組和shNOD2組小鼠尾靜脈注射轉染shNC和shNOD2的HeLa細胞(1×106個細胞),以構建遠處轉移模型。通過Xenogen IVIS光譜體內成像系統(美國PerkinElmer公司)監測肺轉移的熒光強度。8周后,解剖裸鼠的肺,計數肉眼可見的轉移結節的數量。

2 結果

2.1 NOD2與宮頸癌的不良結局相關采用基因表達譜交互式分析(GEPIA,http：//gepia.cancer-pku.cn/)結合了基因型-組織表達(GTEx)數據集,包括306例宮頸癌患者和13例非癌患者,用于檢測NOD2的mRNA表達,并證明NOD2在CC組織中表達明顯高于正常組織,并且不同分期的CC中NOD2的mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)(圖1A、B)。使用TCGA數據集對生存數據的分析揭示,在宮頸鱗狀細胞癌和宮頸腺癌(cervical squamous cell carcinoma,CESC)中,NOD2的高表達與較差的總生存期和無病生存期相關(圖1C、D)。為了確定NOD2的功能作用,課題組檢測了NOD2在CC細胞(HeLa、SiHa、CaSki和ME-180)和人宮頸上皮細胞系Ect1/E6E7中的表達,結果顯示NOD2在CC細胞中表達顯著上調,其中與Ect1/E6E7細胞相比,NOD2在HeLa細胞中表達相對較高,在SiHa細胞中表達相對較低(圖1E)。

2.2 NOD2正向調節CC細胞增殖根據NOD2在CC細胞系中的表達譜,將NOD2高表達的HeLa細胞用于沉默NOD2,和低NOD2表達的SiHa細胞中穩定過表達NOD2(圖2A)。增殖分析結果表明,與shNC組相比,shNOD2組HeLa細胞活力(F=9.14,P<0.01)、集落數、EdU陽性細胞率均顯著降低(t=8.77、10.32,均P<0.01)(圖2B～D);與Vec組相比,NOD2組SiHa細胞活力(F=11.29,P<0.01)、集落數、EdU陽性細胞率均增加(t=4.81、4.61,均P<0.01)(圖2E～G)。

圖2 NOD2正向調節CC細胞增殖 ×50

2.3 NOD2對CC細胞體內外轉移的抑制作用Transwell侵襲試驗顯示,與shNC組相比,shNOD2組HeLa細胞遷移和侵襲數均降低(t=4.70、5.54,P=0.003、<0.01)(圖3A);與Vec組相比,NOD2組SiHa細胞遷移和侵襲數均增加(t=4.66、4.73,P=0.003、0.003)(圖3B)。為了評估NOD2在CC細胞體內轉移中的功能作用,通過尾靜脈將穩定轉染的CC細胞注射到裸鼠中以產生肺轉移模型。8周后,與shNC組相比,shNOD2組中HeLa細胞的肺定殖、肺轉移灶減少(t=4.36、4.52,P=0.009、0.007)(圖3C、D);與Vec組相比,NOD2組中SiHa細胞的肺定殖、肺轉移灶增加(t=4.38、3.81,P=0.009、0.015)(圖3E、F)。

圖3 NOD2對CC細胞體內外轉移的抑制作用

2.4 NOD2調控AMPK/mTOR信號通路為進一步探索NOD2抑制CC進展的機制,用shNC和shNOD2轉染的HeLa細胞中,通過高通量RNA測序(RNA-Seq)進行轉錄組分析。在NOD2下調的HeLa細胞中,451個差異表達的基因(DEGs)上調,892個DEGs下調。隨后,基因集合富集分析(GSEA )結果顯示NOD2的表達與AMPK信號激活和mTOR信號抑制顯著相關,表明NOD2在AMPK/mTOR信號中的潛在調節作用(圖4A、B)。Western blot試驗分析顯示,與shNC組相比,shNOD2組磷酸化AMPK蛋白的表達水平降低(t=9.05,P<0.01),磷酸化mTOR蛋白的表達水平增加(t=11.59,P<0.01);與Vec組相比,NOD2組磷酸化AMPK蛋白的表達水平增加(t=4.70,P<0.01),和磷酸化mTOR蛋白的表達水平降低(t=9.36,P<0.01)(圖4C)。

圖4 NOD2對CC細胞AMPK/mTOR信號通路的影響

2.5 NOD2通過AMPK/mTOR信號介導CC細胞的自噬激活此外,GSEA結果顯示,NOD2的表達與自噬調節途徑激活、自噬體形成顯著相關,表明NOD2在自噬調節中的潛在調節作用(圖5A、B)。因此,進一步評估NOD2在自噬調節中的功能作用。首先,用GFP-mRFP-LC3轉染CC細胞以評估自噬流的形成。與shNC組相比,shNOD2組GFP-mRFP-LC3的點積累減少(t=4.78,P<0.01);與Vec組相比,NOD2的GFP-mRFP-LC3的點積累增加(t=4.52,P<0.01)(圖5C、D)。此外,Western blot試驗分析顯示,與shNC組相比,shNOD2組LC3表達水平減少(t=7.13,P<0.01),p62表達水平增加(t=6.61,P<0.01);與Vec組相比,NOD2組LC3表達水平顯著增加(t=8.43,P<0.01),p62表達水平減少(t=8.75,P<0.01)(圖5E)。

圖5 NOD2通過AMPK/mTOR信號介導CC細胞的自噬激活

3 討論

近年來,盡管CC的臨床治療取得了進展,但預后仍不令人滿意[9]。因此,迫切需要確定更可靠的治療靶點并闡明其對CC進展的影響。本研究使用一系列體外和體內功能喪失和獲得實驗證明了NOD2在抑制CC進展中的作用。首先,對在線數據庫的分析顯示NOD2在CC組織中上調,并且NOD2的表達水平與較差的預后相關。使用各種功能實驗來評估NOD2在CC細胞的增殖、遷移和侵襲中的作用。NOD2顯示出惡性表型。一系列功能獲得實驗證實NOD2在促進CC進展中的作用,顯示NOD2可以通過激活AMPK/mTOR/自噬信號傳導促進CC細胞進展。

轉移性和復發性CC是高度難治的腫瘤,治療具有挑戰性。先前的研究[10]表明,幾種PRRs與CC的發展有關。PRRs的NLR家族已在宿主免疫防御中得到鑒定,其成員NOD2廣泛表達于女性生殖器官,包括子宮內膜、輸卵管、子宮頸和外子宮頸[8]。NOD2在CC的發展中起重要作用,其失調推動宮頸上皮內瘤變發展為CC[11]。研究[8]中,與正常子宮頸相比,CSCC組織中檢測到較高水平的NOD2,尤其在LVSI、淋巴結轉移和低分化腫瘤中特別高表達,并與較差的生存率相關。本研究中,與Ect1/E6E7細胞相比,NOD2在CC細胞中表達顯著上調。這與在結腸癌轉移和乳腺癌細胞系中觀察到的NOD2表達增加一致[12-13]。隨后,體外功能獲得和喪失實驗強調了NOD2在促進CC細胞增殖、遷移和侵襲中的重要作用。尾靜脈注射模型顯示,NOD2過表達導致CC細胞體內遠端器官的轉移率增加。這些體內和體外結果表明,特異性靶向NOD2的shRNAs可以有效抑制CC生長和轉移。然而,NOD2促進CC進展的潛在機制尚未完全研究。

為進一步探索NOD2促進CC進展的機制,在用shNC和shNOD2轉染的HeLa細胞中,通過RNA-Seq進行轉錄組分析顯示NOD2的表達與AMPK信號激活和mTOR信號抑制顯著相關,表明NOD2在AMPK/mTOR信號中的潛在調節作用。研究[14]顯示,AMPK/mTOR信號通路激活可誘導癌細胞自噬和自噬性死亡,從而促進腫瘤的發生和發展。例如,Liu et al[15]報道BDH2通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號傳導抑制腫瘤進展。Tang et al[16]表明沉默AMPK/mTOR信號通路抑制GBM的進展。另一項研究[17]表明,鹽霉素可以通過增加活性氧的產生,從而激活PI3K/AKT/mTOR和ERK/p38 MAPK信號通路,促進細胞自噬。本研究中,NOD2的表達與AMPK信號激活和mTOR信號抑制相關,表明NOD2在AMPK/mTOR信號中的潛在調節作用。因此,癌細胞利用NOD2的細胞保護能力來創造促進癌細胞存活的微環境。

自噬是一種溶酶體依賴的分解代謝途徑,通過該途徑清除受損或衰老的細胞器。自噬在調節癌癥進展和確定腫瘤細胞對化療誘導的應激的反應中起重要作用[10]。然而,自噬在癌癥治療中的作用是多方面的,取決于細胞類型、微環境和腫瘤發展的階段[18]。迄今為止,已經描述了細胞保護性和細胞毒性功能形式的自噬,其中細胞保護性自噬在對化療的反應中更為頻繁[7]。一系列證據表明,自噬通過促進癌細胞存活、細胞增殖、EMT以及耐藥性,在惡性腫瘤的發生發展中發揮細胞保護作用[19]。AMPK/mTOR信號的激活已被證明與自噬激活相關[17]。本研究證實NOD2的表達與自噬調節途徑、自噬體形成顯著相關,表明NOD2在自噬中的潛在調節作用。

綜上所述,這項研究表明,NOD2可能通過AMPK/mTOR信號促進CC增殖、遷移和侵襲,其作用機制部分涉及自噬激活。因此,靶向NOD2可能是治療CC的有前途的治療靶點。