肺腺癌中通過靶向CDT1抑制腫瘤生長及其機制研究

米 源,梁宇翔,王 聰,李德思,宋春濤,蘇 潔,張慶財,王 雷

肺癌是癌癥相關死亡的主要原因,2018年全世界估計有210萬新發肺癌診斷,占全球癌癥負擔的12%。在這一年估計有180萬例病人死于肺癌,占全球癌癥死亡的五分之一[1]。而肺腺癌是最常見的非小細胞肺癌的病理類型。近幾十年來,隨著分子靶向治療和免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICIs)的發展在一定程度上提高了肺腺癌患者的生存率。然而,肺腺癌患者5年生存率仍為19%[2]。因此,迫切需要尋找新的靶點,以優化個性化治療并提高患者生存率。從公共數據庫下載肺腺癌患者的基因數據,通過分析顯示染色質許可和DNA復制因子1(chromatin licensing and DNA replication factor 1,CDT1)是差異基因。CDT1對于DNA復制的啟動是必不可少的,在細胞復制和周期調節過程中發揮了重要作用[3]。近年來,有研究表明CDT1與前列腺癌[4]、急性淋巴細胞白血病[5]等多種腫瘤的發生發展及預后相關。然而,CDT1在肺腺癌的發生發展的具體調控作用及預后的意義未見明確報道。該文旨在探索CDT1在肺腺癌中的表達、臨床意義及潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料人肺腺癌細胞系A549及20對臨床肺腺癌及正常標本均由河北醫科大學第四醫院保存。CDT1過表達載體pEGFP-N1-CDT1和對照載體pEGFP-N1(上海,生工生物工程股份有限公司),si-CDT1和對照si-NC(蘇州吉瑪生物科技有限公司),CDT1和GAPDH引物(美國Thermo Fisher),反轉錄試劑盒(寶日醫生物技術(北京)有限公司),PCR試劑盒(寶日醫生物技術(北京)有限公司),CDT1兔抗人單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司),TPX2兔抗人多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司),p53兔抗人多克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司),GAPDH鼠抗人單克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)。EDU試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),Transwell膜嵌套(美國Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1生物信息分析 TCGA(https：//portal.gdc.cancer.gov/)數據庫下載肺腺癌組織及正常組織基因表達,R語言limma包進行差異表達分析,將P<0.05且log2(foldchange)>1作為差異基因的標準,R語言ggplot2包進行火山圖制作,pheatmap包進行熱圖的制作;survival、timeROC包進行cox回歸分析及制作ROC曲線,corrplot包進行相關性分析;GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)數據庫信息進行肺腺癌CDT1表達的變化。

1.2.2細胞培養和轉染 肺腺癌A549細胞系培養于含有10%胎牛血清的DMEM的高糖培養基中,在5%的CO2、37℃恒溫培養箱中培養,待細胞長到90%左右用含0.25%胰蛋白酶EDTA消化液(不含酚紅)消化細胞,進行1 ∶2傳代培養。將呈對數生長期的細胞接種于6孔板上,細胞生長到50%～60%時,更換無血清培養基,并按照LipofectamineTM3000說明書進行siRNA的轉染,設立實驗si-CDT1組和對照si-NC組。24 h提取mRNA,48 h后收集蛋白。

1.2.3實時熒光定量PCR法檢測基因的表達 將組織或細胞用裂解液進行裂解,按照RNA提取試劑盒說明書提取各組樣本RNA,測定各組RNA濃度,按反轉錄試劑盒進行cDNA的反轉錄。按PCR試劑說明書進行基因擴增。以GAPDH的Ct值作為內參,采用2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.2.4Western blot法檢測相關蛋白表達 PBS洗滌轉染后的A549細胞,用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液收集蛋白,按BCA試劑盒測定總蛋白的濃度。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質。冰水浴轉到PVDF膜。室溫用含5%脫脂奶粉液封膜進行封閉,4 ℃分別加入一抗過夜。次日用TBST洗膜并與二抗孵育1.5 h,最后用ECL試劑來可視化蛋白質條帶,用Image軟件檢測蛋白條帶的表達。

1.2.5流式細胞術檢測細胞周期及增殖的變化 將轉染的A549細胞用75%乙醇制備成單細胞懸液,固定6 h以上后用冷PBS漂洗3次,加入碘化吡啶注意避光。上機檢測周期的變化。收集各組細胞,按照EDU試劑盒說明書進行處理,上機進行檢測。

1.2.6Transwell侵襲實驗 收集轉染后的A549細胞吹打為單細胞懸液進行細胞計數,重懸在無血清培養液中,在上室加入10×104個細胞的培養液。下室加入含10%血清的培養液600 μl,放入細胞培養箱中培養24 h。24 h后經清洗、固定、染色、晾干后在倒置顯微鏡下(×200)視野隨機選取4個視野,觀察穿膜細胞數取平均值。

2 結果

2.1 CDT1生物信息篩查結果及組織表達TCGA數據庫下載肺腺癌組織表達結果顯示CDT1在肺腺癌中高表達(圖1A、B);GO分析表明CDT1與細胞紡錘體組裝相關(圖1C);GEPIA數據庫信息說明在肺腺癌組織中CDT1高表達,課題組也通過PCR檢測臨床20組樣本驗證了數據庫信息的準確性,差異有統計學意義(P<0.000 1)(圖1D、E)。

圖1 生物信息結果及CDT1在肺腺癌組織中表達

2.2 CDT1表達對肺腺癌預后的影響對TCGA數據庫中肺腺癌患者的數據進一步分析,通過單因素Cox及多因素Cox分析結果均顯示CDT1的表達可作為獨立的預后指標(P<0.001)(圖2A、B);通過繪制生存曲線,CDT1與肺腺癌患者的預后相關(P=0.032)(圖2C),繪制CDT1表達水平的ROC曲線,然后計算了ROC曲線下面積(AUC)。對肺腺癌患者1年、3年、5年生存時間的AUC分別為64.3%、62.8%和57.7%,表明CDT1可能是肺腺癌患者預后的預測生物標志物(圖2D)。

圖2 CDT1對肺腺癌預后的分析

2.3 CDT1對免疫治療的預測作用將CDT1表達量與免疫監測點表達量進行pearson相關性分析,具體數值結果(表1),總體相關性分析(圖3A);腫瘤突變負荷(Tumor mutational burden, TMB)已被批準作為免疫檢查點抑制劑的預測生物標志物,分析CDT1與腫瘤突變負荷的關系,結果表明CDT1的表達與腫瘤突變負荷成正相關,表明CDT1的表達與免疫治療的療效密切相關(圖3B)。

圖3 CDT1對免疫治療的預測作用

表1 CDT1表達量與免疫監測點相關性分析

2.4 敲低CDT1在肺腺癌A549細胞中的功能變化通過PCR(t=30.36,P<0.000 1)及Western blot(t=8.801,P=0.000 9)驗證了si-CDT1可以明顯降低CDT1的表達,差異有統計學意義(圖4A、B);流式細胞術顯示si-CDT1組細胞增殖能力明顯降低(t=6.093,P=0.003 7)(圖4C);流式細胞術分析細胞周期顯示si-CDT1組G0/G1期明顯升高(t=11.72,P=0.000 3),差異有統計學意義(圖4D);Transwll實驗顯示CDT1組細胞侵襲能力明顯降低(t=11.52,P=0.000 3),差異有統計學意義(圖4E)。

圖4 沉默CDT1抑制A549細胞的增殖、侵襲

2.5 敲低、過表達CDT1后p53、TPX2的表達變化敲低CDT1后p53(t=3.434,P=0.026 4)表達相對于對照組表達明顯升高,TPX2(t=12.35,P=0.000 2)表達明顯降低,差異有統計學意義;過表達CDT1后p53(t=3.758,P=0.019 8)表達明顯降低,TPX2(t=6.944,P=0.002 3)表達明顯升高,差異有統計學意義。見圖5。

圖5 敲低、過表達CDT1后p53、TPX2的表達變化

3 討論

肺癌是全球癌癥死亡的主要死因,2020年全球有2 206 771例新發肺癌病例和 1 796 144例死亡病例[6],而肺腺癌又是其主要亞型。盡管近幾十年來免疫治療、放療和手術切除等多模式治療策略取得了長足進步,但治愈肺癌的結果仍不盡如人意,其5年生存率不到20%[6]。因此,迫切需要有效的肺腺癌生物標志物和新的治療靶點。

有研究[7]表明CDT1與多種腫瘤的預后相關,但在肺腺癌中作用機制及預后未見明確報道。本研究中,數據庫信息及臨床樣本顯示CDT1在肺腺癌組織中高表達,因此CDT1有望作為肺腺癌治療新的靶點。

TCGA數據庫分析結果表明CDT1可作為預測肺腺癌的預后指標,高表達的CDT1患者與低存活率有關。并且1年內準確性是更高的。并且近年來,針對免疫檢查點的免疫療法的臨床應用提高了臨床療效,改變了肺腺癌的治療范式[8]。因此課題組將CDT1的表達與免疫監測點表達量進行了相關性分析,在這些分子中與CD276正相關最大, CD276是一種共刺激/共抑制分子,作為一種共刺激分子,CD276信號誘導細胞免疫及增強細胞毒性T細胞的生成,而作為一種共抑制分子可以抑制Treg細胞,從而誘導腫瘤免疫逃逸反應[9]。

最后本研究將CDT1的表達與腫瘤突變負荷(Tumor mutational burden, TMB)進行了相關性分析, TMB是指腫瘤細胞中體細胞突變的總負荷。高TMB患者可能對免疫治療有反應。TMB已被開發作為免疫檢查點抑制劑的一種預測性生物標志物[10]。該實驗結果表明CDT1表達與TMB成正相關。綜上結果表明CDT1的表達與肺腺癌的免疫治療存在密切的關系。

隨后CDT1對腫瘤細胞功能的影響進行了實驗驗證。通過siRNA敲低CDT1基因后,發現肺腺癌增殖能力下降,G0/G1期細胞明顯增加。這與Cai et al[3]在前列腺癌細胞中也發現敲低CDT1抑制腫瘤的增殖及改變細胞周期的結果是相一致的。侵襲和轉移的激活是癌癥的主要特征之一[11]。又通過Transwell實驗驗證了敲低CDT1后細胞侵襲轉移能力明顯下降。Maimaiti et al[12]在乳腺癌中同樣發現影響CDT1可以改變腫瘤的侵襲轉移能力,本文結果與之一致。

接下來本研究進一步對CDT1可能影響腫瘤的通路進行了驗證。首先通過腫瘤蛋白互作網絡的結果發現CDT1與非洲爪蟾驅動蛋白樣蛋白2(TPX2)關系密切。TPX2是有絲分裂紡錘體功能所需的微管相關蛋白,不僅在細胞周期中起作用,還參與腫瘤轉移、凋亡等過程[13],同時Chen et al[14]發現在乳腺癌中靶向TPX2可以通過激活p53抑制腫瘤的增殖。Western blot顯示敲低CDT1后,TPX2表達降低、p53表達增加,而過表達CDT1后相應蛋白的表達發生了相反的變化。綜上結果表明敲低CDT1可能通過影響TPX2促進p53的表達達到抗腫瘤的結果。

本研究揭示了CDT1在肺腺癌的發生發展中的潛在意義和可能機制,但仍存在一定的局限性。首先,CDT的功能評估尚缺乏體內實驗的驗證。其次, CDT1的表達與預后意義需要多中心的臨床樣本去驗證。最后,盡管這項研究表明CDT1在調節細胞周期和影響免疫治療的機體分子機制有待進一步探索。

綜上所述,本研全面系統地評價了CDT1在肺腺癌的發展及預后的影響。為肺腺癌的治療確定了新的預后生物標志物和治療靶點。