脂多糖干預后的不同滑膜細胞來源炎性外泌體對軟骨細胞的作用機制研究

周 俊,郭長青,王慶甫

膝關節骨性關節炎(knee osteoarthritis,KOA)是由高齡、外傷、勞損、遺傳、肥胖等因素引起的慢性無菌性炎癥。基本的病理過程包括軟骨降解和滑膜炎癥。滑膜炎癥可以出現于KOA病程的任意過程,且研究[1]表明,滑膜炎癥常作為軟骨炎癥的前兆癥狀,并且與軟骨退變、損傷、骨贅形成等臨床癥狀多呈正相關[2-3]。TLRs/NF-κB信號通路介導的炎癥反應與軟骨細胞的壞死、凋亡關系密切[4]。正常的膝關節滑膜組織由A型滑膜細胞(巨噬細胞樣滑膜細胞,macrophage-like synoviocytes,MLS)、B 型滑膜細胞 (成纖維細胞樣滑膜細胞, fibroblast-like synoviocytes,FLS)組成[5]。外泌體(exosomes) 是一種由細胞主動分泌到胞外的具有脂質雙層膜結構的微小囊泡,其在細胞間信息交流、功能調控方面發揮巨大的作用[6]。該研究擬通過離體實驗觀察炎性環境下不同滑膜細胞來源外泌體對于軟骨細胞的影響,探討不同細胞來源炎性外泌體干預軟骨細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人成纖維樣滑膜細胞系、巨噬樣滑膜細胞系(上海ATCC細胞庫);DMEM培養基、胎牛血清(美國Bio-Rad公司);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(美國Sigma公司);RYPSIN 0.25%胰酶(美國Invitrogen公司);外泌體提取收集試劑盒(北京恩澤康泰公司);烏磷酸(美國Sigma公司);96孔細胞培養板(美國Corning公司);CCK-8 試劑(南京諾唯贊公司);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6 Elisa試劑盒(美國 abcam 公司) ;Toll樣受體4(Toll-like receptor4, TLR4)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、核因子κB抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase, IkK)、核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB, IκB)、金屬肽酶含血小板反應蛋白基元5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5, ADAMTS5)單克隆抗體(美國 abcam 公司);辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體(美國 abcam 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1LPS誘導滑膜細胞炎癥 將凍存的兩種滑膜細胞分別置于37 ℃水浴箱中,不時搖動使其迅速融化后將細胞懸液轉移至離心管中并利用離心機 1 000 r/min離心5 min,吸棄上清液,加入適量含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗的無外泌體DMEM培養基重懸后,分別轉移至培養瓶中,置于5%CO2,飽和濕度90%的37 ℃恒溫培養箱中培養。穩定傳代至3-4代后,各取2瓶FLS和MLS,加入新的含雙抗無外泌體培養基后,在其中1瓶FLS及MLS中分別加入5 μl LPS/PBS溶液(1 μg/ml),另外兩瓶滑膜細胞不做其余處理,干預24 h后收集兩種細胞的上清液;將正常的3-4代FLS和MLS以1 ∶4 的比例接種于同一培養瓶中,加入含雙抗無外泌體培養基,再加入5 μl LPS/PBS溶液(1 μg/ml)干預,模擬KOA環境,24 h后收集細胞上清液,分別置于-80 ℃冰箱中凍存,用于后續實驗。

1.2.2用尺寸排阻加超濾法(SECF)提取細胞上清液中外泌體 將Exosupur柱固定在裝置架上,使柱內溫度與室溫持平,打開柱子上下的封蓋回收封柱液,將15 ml離心管置于柱子下方,從柱子頂部加入PBS進行沖洗,保持柱子濕潤,沖洗完成后將細胞上清液從柱子頂部加入,收集底部流出液,前1 500 μl不用收集,之后收集的成分即為外泌體成分,將所得外泌體置于-80 ℃下保存備用。

1.2.3電鏡觀察兩種細胞外泌體形態 將10 μl外泌體重懸液滴加在電鏡的載樣銅網上,室溫下靜置5 min,用濾紙從側方將多余的液體吸干,滴加10 μl 4%磷鎢酸溶液于銅網上,室溫負染5 min。濾紙吸干負染液,白熾燈下烤干后,于透射電子顯微鏡下觀察并在80 kV下成像。

1.2.4軟骨細胞提取與培養 軟骨組織取自于北京中醫藥大學第三附屬醫院行全膝關節置換術的膝骨關節炎患者,患者對實驗過程完全知情并簽署知情同意書,收集術中取出的廢棄軟骨組織并立即送至實驗室進行細胞提取。該研究已通過北京中醫藥大學第三附屬醫院倫理委員會審查 (倫理號BZYSY-2019KYKTPJ-26)。

將術中取得的軟骨組織用含1%雙抗的PBS漂洗3次,用眼科手術剪將附著軟骨塊的軟組織剪除,再剪為1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片,加入約10倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶,使軟骨碎片懸浮,放入5%CO2,飽和濕度90%的37 ℃恒溫培養箱中過夜,用70 μm細胞過濾網過濾后,1 000 r/min離心5 min,獲得軟骨細胞。將細胞接種于培養瓶中,加入含雙抗無外泌體培養基,置于培養箱中培養,選取第3-4代細胞用于后續實驗。

1.2.5炎性滑膜細胞外泌體干預軟骨細胞 取3-4代軟骨細胞,分別置于5個培養瓶中,并標記Ⅰ-Ⅴ。在5組培養瓶中分別等量加入含雙抗無外泌體培養基。將1.2.2中所得各組外泌體用生理鹽水制備成混懸液(濃度為1×107/ml)。第Ⅰ、Ⅱ組軟骨細胞中分別加入正常的MLS和FLS外泌體,第Ⅲ組加入2種細胞共培養的炎性外泌體,第Ⅳ、Ⅴ組加入分別加入炎性的MLS和FLS外泌體。各組干預24 h后,光鏡下觀察各組軟骨細胞形態。分別收集各組軟骨細胞及上清液并置于-80 ℃冰箱中凍存,用于后續實驗研究。

1.2.6CCK-8法檢測各組軟骨細胞活力 取3-4代軟骨細胞,計數,用培養基使軟骨細胞懸浮,調整細胞濃度1×105個/ml,接種于96孔板,各孔加0.1 ml細胞懸液,分為5組,分別加入對應的外泌體混懸液：第Ⅰ、Ⅱ組軟骨細胞中分別加入正常的MLS和FLS外泌體,第Ⅲ組加入兩種細胞共培養的炎性外泌體,第Ⅳ、Ⅴ組加入分別加入炎性的MLS和FLS外泌體。放入恒溫培養箱中過夜,用倒置相差顯微鏡觀察各組軟骨細胞形態。向每組孔中加入10 μl CCK-8溶液,放入恒溫孵育箱中再次孵育3 h后使用酶聯免疫檢測儀在 450 nm雙波長處測得相應吸光度值(absorbance,A)。

1.2.7ELISA法檢測各組軟骨細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平 將各組軟骨細胞上清液室溫解凍搖勻后,ELISA法檢測其中中TNF-α、IL-1β、IL-6水平,按照試劑盒操作步驟執行,每個指標設置3個復孔。

1.2.8Western blot法檢測軟骨細胞中TLR4、NF-kB、IkK、IκB、ADAMTS5蛋白的表達 收集各組軟骨細胞,用PBS洗滌細胞沉淀3次,1 000 r/min離心5 min,吸棄上清液后加入0.2 ml的蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑混合液;4 ℃低溫離心機12 000 r/min離心15 min后,取上清液置于新EP管中,標記分組。用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定,取適量蛋白進行電泳,電泳完成后進行電轉,將目標蛋白轉移至PVDF膜上,室溫下將膜完全浸沒在3% BSA-TBST中輕搖30 min。用3% BSA-TBST稀釋(1 ∶1 000)一抗,參照TLR4、NF-κB、IkK、IκB、ADAMTS5及內參β-actin等抗體說明書進行一抗標記,TBST清洗4次后,加入3% BSA-TBST稀釋(1 ∶1 000)后的二抗室溫孵育1 h,最后加入ECL試劑后顯影。

2 結果

2.1 電鏡下觀察兩種滑膜細胞外泌體形態電鏡下可見兩種外泌體均為顆粒直徑為30～150 nm范圍內的圓形或橢圓形膜性微囊泡結構,內含有致密的云狀物質,為外泌體內容物。

圖1 電鏡下觀察兩種滑膜細胞外泌體形態 ×500

2.2 各組軟骨細胞的生長形態顯微鏡下觀察正常外泌體干預的兩組軟骨細胞多為圓形、橢圓形及短梭形,貼壁生長,與未經干預的正常軟骨細胞形態基本相似;炎性外泌體干預的三組軟骨細胞形態出現不規則型,有較多的懸浮壞死細胞,細胞密度低于另外兩組。見圖2。

圖2 各組軟骨細胞生長形態 ×10

2.3 各組軟骨細胞A值Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組軟骨細胞活力低于Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ組細胞活力幾乎沒有差異。Ⅳ組細胞活力最低,Ⅲ組細胞活力高于Ⅳ組但低于V組(P<0.05)。見表1。

表1 各組軟骨細胞A值

2.4 各組軟骨細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平Ⅰ、Ⅱ兩組細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平沒有差異;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于Ⅰ、Ⅱ兩組(P<0.05);Ⅲ組細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于Ⅳ組(P<0.05),但低于V組(P<0.05)。見表2。

表2 Elisa法檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

2.5 各組軟骨細胞中TLR4、NF-κB、IkK、IκB、ADAMTS5的表達量Ⅰ、Ⅱ兩組軟骨細胞TLR4、NF-κB、IkK、IκB、ADAMTS5的蛋白表達量沒有差異;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組軟骨細胞TLR4、NF-κB、IkK、IκB、ADAMTS5的蛋白表達量高于Ⅰ、Ⅱ兩組(P<0.05);Ⅲ組軟骨細胞TLR4、NF-κB、IkK、IκB、ADAMTS5的蛋白表達量高于Ⅳ組(P<0.05),但低于Ⅴ組(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 各組軟骨細胞中相關蛋白表達量與actin比值

圖3 Western blot檢測各組軟骨細胞TLRs/NF-κB信號通路相關蛋白表達印跡圖

3 討論

KOA是一種以滑膜炎癥、軟骨退變為主要病理變化的退行性疾病[6-10]。滑膜炎癥導致滑膜細胞釋放的炎性因子和基質蛋白酶是誘發軟骨炎癥、加重軟骨損傷的重要因素[11]。人體膝關節滑膜組織主要由MLS和FLS兩種細胞組成。MLS是來源于骨髓的巨噬細胞通過循環系統遷徙至滑膜下層,約占滑膜細胞總數的約20%,它可以吞噬關節腔內碎屑、異物并釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子。FLS占滑膜細胞總數的約80%,它具有分泌透明質酸,合成膠原蛋白及分泌產生基質蛋白酶的功能[12]。外泌體攜帶有來自細胞的蛋白,脂質及核酸等物質。在細胞間信息交流和細胞功能調控方面發揮著重要作用[13]。不同細胞來源的外泌體具備不同的特點和功能。觀察不同滑膜細胞來源的外泌體在炎癥過程中的特點和功能差異,有助于進一步研究KOA的病理過程和治療方法。TLRs/NF-κB信號通路可以調節膝關節滑膜及軟骨細胞產生免疫和炎癥反應。一般狀態下,NF-κB與NF-κB抑制蛋白(IκB)結合成二聚體結構而處于活性抑制狀態。在KOA中,由于軟骨損傷或退化產生體內損傷相關分子模式( DAMPs)和炎性因子,Toll樣受體是一類重要的模式識別受體(如TLR2、TLR4等),其可通過識別DAMPs而激活,并使得IkK活化,該激酶可以激活IκB,使其從二聚體上解離,激活NF-κB信號通路。產生IL-1β、IL-6、TNF-α等下游因子,引起滑膜和軟骨炎癥,同時產生MMP-13和ADAMTs等可以使軟骨外基質降解,導致軟骨細胞壞死[14]。

本研究中三組炎性外泌體干預后的軟骨細胞均出現了細胞變形,懸浮,壞死的情況。說明炎性滑膜細胞外泌體可以影響軟骨細胞活力。用CCK-8法觀察各組軟骨細胞活力,三組炎性外泌體干預組的軟骨細胞活力比正常外泌體干預后的軟骨細胞差,兩種滑膜細胞共培養后的炎性外泌體干預后的軟骨細胞活力高于炎性FLS外泌體而低于炎性MLS外泌體。ELISA法和Western blot法檢測結果亦顯示三組炎性外泌體組均可激活軟骨細胞中TLRs/NF-κB信號通路并產生炎性因子,其中兩種滑膜細胞共培養后的炎性外泌體致炎效果強于FLS外泌體而弱于MLS外泌體。在KOA中兩種滑膜細胞均會產炎性因子,其中FLS還會一些抗炎因子如前列腺素和血管內皮生長因子等,同時巨噬細胞可以根據微環境的變化由具有促炎作用的M1型轉化為具有生抗炎和組織修復作用的M2型[15]。有研究[16-17]通過成纖維細胞與巨噬細胞體外共培養,顯示巨噬細胞的促炎因子釋放得到抑制,這可能是由于成纖維細胞體表的CD14+蛋白的中和作用導致的。在本實驗中,兩種細胞共培養后MLS外泌體的致炎作用得到一定抑制,可能由于FLS外泌體對于MLS的炎性因子釋放和M1、M2兩種亞型的轉變有一定的調控作用,有待進一步的實驗驗證。總之在KOA的炎癥過程,兩種細胞之間既可以相互促進炎癥釋放,又可互相抑制其致炎作用,處于促炎與抗炎的動態平衡中,而外泌體在兩種細胞的信息交流中發揮了重要作用。

綜上所述,在KOA疾病進展過程中,兩種滑膜細胞來源外泌體均可通過調控軟骨TLRs/NF-κB信號通路,促進軟骨細胞外基質降解,加重軟骨退變。兩種細胞通過其外泌體進行細胞間信號交流,既可以相互促進又會抑制致炎效果。本實驗為KOA的機制研究和臨床用藥開發提供了新的途徑和思路。