全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像定量參數(shù)MRFDGmax和SUVmax在大鼠肝炎、肝纖維化及肝硬化階段的應(yīng)用價值

施慧敏,張金洲,王 馨,朱 干,趙學(xué)峰,汪 會

由于病毒在肝臟中連續(xù)復(fù)制的特性,機(jī)體免疫系統(tǒng)會對病毒感染的肝細(xì)胞持續(xù)攻擊,反復(fù)的肝損傷加重了機(jī)體的炎癥和纖維化,進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不?繼而引發(fā)肝功能衰竭[1]。 正電子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像 (positron emission tomography/ computed tomography,PET/CT)除了對腫瘤之外,對炎癥、感染和一些退行性病也適用,而氟代脫氧葡萄糖(18F-Fluorodeoxyglucose,18F-FDG)是PET檢查中常用的放射性藥物,可以定量測定肝臟中的葡萄糖代謝,可在炎癥部位和感染部位累積[2]。全身動態(tài)18F-FDG PET/CT patlak顯像中最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(maximum standardized uptake value,SUVmax)是游離性六磷酸酶參與代謝,已被證明為有用的半定量測量方法,最大代謝率(the maximum metabolic rat of FDG, MRFDGmax)測得的是真實的六磷酸酶參與代謝,屬于絕對化定量分析,避免了時間依賴性,具有傳統(tǒng)顯像無法獲得的FDG代謝的動力學(xué)信息[3]。該實驗擬構(gòu)建大鼠肝炎、肝纖維化、肝硬化模型,通過全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像,探討定量參數(shù)MRFDGmax、SUVmax在大鼠肝炎、肝纖維化及肝硬化階段的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器98%四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)溶液購自合肥寶添科貿(mào)有限公司;橄欖油及乙醇溶液購自上海麥克林生化科技有限公司;α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)免疫組化試劑購自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司。顯像采用德國Siemens Biograph Vision PET/CT儀;18F-FDG購自南京江原迪科正電子研究發(fā)展有限公司。

1.2 實驗動物雄性SD大鼠24只,6～7周齡,體質(zhì)量170～210 g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[許可證號(SCXK(遼)2020-0001]。所有大鼠都被飼養(yǎng)于溫度為26±1 ℃,相對濕度為(50±1)%,光/暗周期為12/12 h的SPF級動物房中,所有實驗動物方案均獲安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn),批號：LLSC20221252。

1.3 實驗動物分組及處理本研究選取造模成功的大鼠分為肝炎、肝纖維化、肝硬化、正常組,每組6只,進(jìn)行實驗研究分析。正常組給予正常飲食,各模型組均采用左右腹部皮下交替注射50% CCl4油溶液加乙醇復(fù)合法進(jìn)行誘導(dǎo),每4 d注射1次,乙醇溶液為唯一飲用水,詳見圖1 。

圖1 各組SD大鼠模型誘導(dǎo)流程圖

1.4 全身動態(tài)18F-FDG PET/CT顯像分別對4組大鼠進(jìn)行顯像,顯像前禁食8 h,可自由飲水,采集圖像前將大鼠用異氟烷麻醉并仰臥位固定于PET/CT掃描床上,先進(jìn)行5 s低劑量的全身CT采集(管電壓120 KV,管電流160 mA,螺距5.0 mm),然后將檢查床移動于PET檢查視野內(nèi),在大鼠尾靜脈注射37 MBq的18F-FDG,注射同時開始以心臟為中心進(jìn)行6 min動態(tài)單床PET掃描,隨后進(jìn)行18次連續(xù)全身PET掃描,動態(tài)掃描時間75 min。掃描結(jié)束后,對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行重建(參數(shù)：迭代4,子集5,矩陣為128×128),重建結(jié)束后,以左心室為感興趣體積進(jìn)行勾畫,生成左心室時間-活度曲線(tumor time activity curve, TAC),并作為輸入函數(shù)利用Patlak圖像分析獲得MRFDGmax,從而生成MRFDG參數(shù)圖像,取最后一幀動態(tài)掃描所獲得的圖像為SUVmax圖像。在掃描過程中時刻關(guān)注大鼠生存狀態(tài)。

1.5 圖像分析由2位資深核醫(yī)學(xué)科醫(yī)師對圖像進(jìn)行分析,選取肝組織受損最大層面勾畫感興趣區(qū)域(region of interest,ROI),測量肝臟的MRFDGmax、SUVmax和CT值并對體質(zhì)量的MRFDGmax和SUVmax進(jìn)行校正。

1.6 生化指標(biāo)與組織病理檢測PET/CT顯像完成后采取頸椎脫臼法處死大鼠,對大鼠進(jìn)行腹主動脈取血,采血結(jié)束后迅速取出肝臟。全血標(biāo)本于室溫放置2 h后于2～8 ℃,3 000 r/min,離心15 min,取上清液利用自動生化分析儀檢測大鼠各階段血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的水平。取出肝臟并用體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋4 μm切片,正常組、肝炎組及肝硬化組行HE染色,肝纖維化組行Masson染色。免疫組化檢測α-SMA表達(dá)情況,在高倍鏡視野下每張切片隨機(jī)取5個視野拍照,使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物造模存活情況整個實驗造模共選取48只大鼠,分別為正常組8只,肝炎組10只,肝纖維化組12只,肝硬化組18只。見圖2。造模結(jié)束后,正常組大鼠無死亡,肝炎組大鼠死亡1只,肝纖維化組大鼠死亡1只,肝硬化組大鼠死亡3只,造膜成功后每組隨機(jī)選取6只進(jìn)行全身動態(tài)18F-FDG PET/CT掃描。

圖2 Kaplan-Meier 法分析各組SD大鼠生存率

2.2 全身動態(tài)18F-FDG PET/CT顯像結(jié)果全身動態(tài)PET/CT顯像示,各組SD大鼠肝臟模型均有不同程度的彌漫性放射性攝取,詳見圖3。各組的MRFDGmax值與SUVmax差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.35,P<0.001;F=84.54,P<0.001)。肝纖維化組和肝硬化組的CT值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.407,P=0.693)。正常組、肝炎組分別與肝纖維化組及肝硬化組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=112.25,P<0.001),CT圖結(jié)果顯示低分辨率CT不能鑒別肝纖維化組及肝硬化組大鼠肝臟密度差異,詳見圖4。

圖3 各組SD大鼠全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像圖

圖4 各組大鼠MRFDGmax(A)、SUVmax(B)及CT值 (C)統(tǒng)計分析圖

2.3 生化檢測結(jié)果與正常組相比,肝炎組、肝纖維化組及肝硬化組AST、ALT及ALP呈階段性上升,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=93.32、64.63、145.03,P<0.001或=0.002),詳見表1 。

表1 各組大鼠血清檢測指標(biāo)變化

2.4 病理學(xué)檢測結(jié)果鏡下觀察,正常組HE染色顯示肝細(xì)胞排列整齊,小葉結(jié)構(gòu)顯示完整,未見肝細(xì)胞變性、淤血、增生;肝炎組HE染色可見大量的肝細(xì)胞脂肪變性,胞質(zhì)內(nèi)見大小不一的圓形空泡及炎性細(xì)胞小灶性的浸潤,即造模成功;肝纖維化組Masson染色示肝臟組織局部可見被膜增生變厚,多見竇周或匯管區(qū)的膠原纖維增生形成短纖維間隔,即造模成功;肝硬化組HE染色顯示組織中廣泛可見大量血管周圍有結(jié)締組織增生,形成大量橋接及假小葉,伴有淋巴細(xì)胞浸潤,多見核分裂像,即造模成功。肝炎組、肝纖維化組及肝硬化組α-SMA陽性細(xì)胞表達(dá)增加,呈階段性上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=80.57,P<0.001),詳見圖5、6。

圖5 各組SD大鼠肝臟組織病理及免疫組織化結(jié)果 ×400

圖6 各組SD大鼠肝臟α-SMA陽性細(xì)胞表達(dá)

2.5 指標(biāo)相關(guān)性分析4組肝臟組織SUVmax與MRFDGmax呈明顯正相關(guān)(r=0.967,P<0.01),肝炎組、肝纖維化組及肝硬化組中α-SMA陽性細(xì)胞表達(dá)整體與AST、ALT、ALP均呈正相關(guān)(r=0.924、0.756、0.934,P<0.01),詳見圖7。

圖7 SUVmax與MRFDGmax(A),α-SMA與AST(B)、ALT(C)、ALP(D)相關(guān)性分析

3 討論

肝炎、肝纖維化和肝硬化均導(dǎo)致肝臟功能損害,而肝硬化是全球相關(guān)肝臟死亡的主要影響因素[4]。臨床上主要依靠于檢驗、肝活檢穿刺、CT及多普勒超聲等了解病變的程度,以上方法均有明顯的不足之處,如肝活檢穿刺為有創(chuàng)性檢查,CT值對于肝纖維化與肝硬化區(qū)分不明顯,多普勒超聲易受操作者影響,可重復(fù)性差。而全身動態(tài)18F-FDG PET/CT可以廣泛監(jiān)測組織代謝及炎癥部位的累積,以分子水平的方式對病灶進(jìn)行診斷分析。本實驗通過全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像,由實驗結(jié)果得出定量參數(shù)MRFDGmax和SUVmax值對監(jiān)測肝炎、肝纖維化和肝硬化階段具有一定的應(yīng)用價值。

動脈采血作為輸入函數(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,為有創(chuàng)性操作且完成難度大,以心臟為ROI作為輸入函數(shù)可減小操作難度并為無創(chuàng)性[5]。在此基礎(chǔ)上,全身動態(tài)PET/CT通過動態(tài)監(jiān)測獲取左心室TAC作為輸入函數(shù),用于Patlak分析肝組織中的MRFDGmax,其僅反映組織中參與代謝的葡萄糖水平,抑制了血池中葡萄糖信號、背景組織攝取及游離葡萄糖對病灶分析的影響,已經(jīng)被用于更具體地評估示蹤劑的攝取,能實現(xiàn)對病灶的定量分析[6]。SUVmax反映靶組織中總葡萄糖的攝取,是最常見的半定量分析指標(biāo),SUVmax與MRFDGmax之間具有顯著相關(guān)性,參數(shù)MRFDGmax與SUVmax互補(bǔ)能夠?qū)Σ≡钸M(jìn)行更準(zhǔn)確的分析[7-8]。近年來,在肝炎發(fā)展為肝纖維化進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不那闆r下,18F-FDG被用于測定肝組織中葡萄糖代謝,炎癥細(xì)胞中不可逆的FDG積累導(dǎo)致肝臟FDG攝取的增加,隨著肝臟代謝和功能下降的加重,活躍的炎癥細(xì)胞減少,是肝硬化肝臟中FDG攝取減少的潛在原因[9]。在本實驗中通過全身動態(tài)PET/CT Patlak分析MRFDGmax與SUVmax的變化來反映肝臟組織對18F-FDG的攝取程度,從而反映肝組織的受損階段;肝炎組和肝纖維化組的肝組織MRFDGmax、SUVmax均較正常組增高,增加了對18F-FDG的攝取,反映出受損肝組織的炎癥細(xì)胞活躍程度,而肝硬化組MRFDGmax、SUVmax較正常組降低,炎癥細(xì)胞減少,對18F-FDG攝取減少;綜上表明在SUVmax半定量分析的基礎(chǔ)上引入MRFDGmax值用于確定代謝率,對影響SUVmax測量的變化表現(xiàn)出更大的穩(wěn)健性。

組織血清中一些重要的生化指標(biāo)水平可作為肝損傷的重要診斷因素,有研究[10]表明AST、ALT及ALP是肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)酶,高AST、ALT、ALP與炎癥及纖維化程度具有較高相關(guān)性。α-SMA是肝星狀細(xì)胞被激活狀態(tài)下所表達(dá)的,肝細(xì)胞中α-SMA陽性表達(dá)的增加,參與膠原生成的蛋白質(zhì)增多,加劇了肝星狀細(xì)胞纖維化的進(jìn)程,因此α-SMA被認(rèn)為是肝纖維化進(jìn)程中的重要標(biāo)志[11-12]。生化結(jié)果顯示隨著肝損傷程度的增加,AST、ALT、ALP的水平較正常組不斷增高,且免疫組化結(jié)果顯示α-SMA在肝炎組、肝纖維化組及肝硬化組中表達(dá)不斷增加,α-SMA分別與AST、ALT、ALP呈正相關(guān),進(jìn)一步驗證了全身動態(tài)18F-FDG PET /CT Patlak顯像結(jié)果與組織病理學(xué)檢查結(jié)果一致,且在實驗動物存活的情況下,用非侵入性的方法觀察肝炎、肝纖維化和肝硬化階段肝臟代謝參數(shù)的改變,對臨床早發(fā)現(xiàn)早預(yù)防具有重要意義。